Quantificação de pontos filamentosos de actina em neurônios corticais de ratos

Resumo

Fonte: Li, H., et al. Quantificação de Pontos de Actina Filamentosa (F-actina) em Neurônios Corticais de Rato. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento para coloração fluorescente de neurônios corticais de ratos para microscopia. Ele tem como alvo a F-actina e as proteínas dendríticas para analisar a integridade estrutural e calcular a densidade da F-actina, que é crucial para estudar a função e a saúde neuronal.

Protocolo

1. Marcação fluorescente e imunocitoquímica

Nota: A marcação imunofluorescente de culturas de células corticais primárias foi realizada em placas de cultura de células de 35 mm com fundo de vidro com volume de trabalho de 1 ml.

1. Lave o prato com fundo de vidro duas vezes com solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS).
2. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente (RT).
3. Lave as células duas vezes com PBS e permeabilize com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 5 min.
4. Trate as células por 20 min em RT com uma coloração específica para actina F (filamentosa), AlexaFluor 488 Faloidina (1:40, 25 μl de Faloidina em 1 ml de PBS).
5. Enxágue as células duas vezes com PBS e bloqueie com soro de cabra normal a 10% em RT por 1-2 horas.
6. Dilua o anticorpo policlonal anti-MAP2 (proteína 2 associada aos microtúbulos) de frango (1:2.500) em PBS com 2% de soro de cabra normal e incube O/N (durante a noite) a 4 ⁰C.
7. Após a incubação, enxágue em PBS duas vezes.
8. Dilua o anticorpo secundário (Alexa Red 594-conjugado com cabra anti-frango IgG (1:500) com 2% de soro de cabra normal e incube por 2 horas em RT.
9. Enxágüe com PBS e adicione 10 μl/prato de corante Hoescht.
10. Incubar por 3 min em RT e lavar com PBS duas vezes.
    nota: As células marcadas estão agora prontas para a etapa 2 (contagem de puncta de F-actina).
11. Preserve a amostra de célula com 100 μl de reagente antidesbotamento como agente de lamínula e mantenha-a a 4 ⁰C no escuro para armazenamento de longo prazo.
    nota: A faloidina é relativamente estável em PBS a +4 °C no escuro por até 1 semana, e a fluorescência pode ser preservada com reagentes antidesbotamento de lamínula. No entanto, as imagens ideais são obtidas de 1 a 3 dias após a coloração, pois a faloidina pode começar a se difundir com o armazenamento prolongado.

2. Contagem de F-actina Puncta

1. Ligue o microscópio fluorescente e mude para a objetiva de 20×. Abra o software do microscópio e configure o programa com tamanho de imagem de 1280×960 pixels e resolução de imagem de 0,17 μm/pixel com zoom de 1×.
2. Adquira imagens de neurônios F-actin/MAP2 co-marcados sob canais fluorescentes verdes (495 nm) ou vermelhos (613 nm).
3. Escolha 5 imagens imunomarcadas com verde (F-actina) / vermelho (MAP2) / azul (Hoescht) de neurônios individuais com árvores dendríticas claramente definidas.
4. Identifique as estruturas ricas em F-actina no segmento dendrítico de segunda ordem (faixa de comprimento 25-75 μm) com imunofluorescência contínua de MAP2.
5. Gire a região selecionada das imagens para um nível horizontal. Copie e cole como uma nova imagem.
6. Subtraia o fundo das imagens, usando um ajuste consistente para cada prato.
7. Conte os pontos de F-actina verde brilhante e trace o comprimento do segmento dendrítico selecionado manualmente por observadores independentes treinados. Exporte os dados para um arquivo de planilha.
8. Calcule a densidade dividindo o total de pontos marcados com F-actina (N) pelo comprimento (L) dos dendritos marcados com MAP2. Expresse os dados como o número de pontos de F-actina por 10 μm de dendrito
   nota: Pontos (tamanho ≤1,5 μm) de fluorescência de F-actina com intensidade de pico de pelo menos 50% acima da intensidade média de coloração na haste dendrítica foram incluídos em cada segmento dendrítico selecionado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pratos com fundo de vidro de 35 mm Nº 1,5 lamínula	Corporação MatTek	P35G-1.5-20-C
Meio DMEM/F12	Tecnologias da Vida	10565-018
Poli-L-lisina	sigma	Pág. 9155
Paraformaldeído	sigma	Pág. 6148
AlexaFluor 488 Faloidina	Tecnologias da Vida	A12379
Soro normal de cavalo	Tecnologias da Vida	Rolamento 26050-070
Frango policlonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 IgG anti-frango de cabra conjugada	Tecnologias da Vida	Rolamento A11042
NucBlue Coloração de células vivas ReadyProbes Reagente Hoescht 33342	Tecnologias da Vida	R37605
Pacote de software NIS-Elements	Instrumentos Nikon
Nikon Eclipse TE2000-E microscópio fluorescente invertido controlado por computador	Instrumentos Nikon