Quantificação de pontos filamentosos de actina em neurônios corticais de ratos

Resumo

Fonte: Li, H., et al. Quantificação de Pontos de Actina Filamentosa (F-actina) em Neurônios Corticais de Rato. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o procedimento para coloração fluorescente de neurônios corticais de ratos para microscopia. Ele tem como alvo a F-actina e as proteínas dendríticas para analisar a integridade estrutural e calcular a densidade da F-actina, que é crucial para estudar a função e a saúde neuronal.

Protocolo

1. Marcação fluorescente e imunocitoquímica

Nota: A marcação imunofluorescente de culturas de células corticais primárias foi realizada em placas de cultura de células de 35 mm com fundo de vidro com volume de trabalho de 1 ml.

1. Lave o prato com fundo de vidro duas vezes com solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS).
2. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 min em temperatura ambiente (RT).
3. Lave as células duas vezes com PBS e permeabilize com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 5 min.
4. Trate as células por 20 min em RT com uma coloração específica para act....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pratos com fundo de vidro de 35 mm Nº 1,5 lamínula	Corporação MatTek	P35G-1.5-20-C
Meio DMEM/F12	Tecnologias da Vida	10565-018
Poli-L-lisina	sigma	Pág. 9155
Paraformaldeído	sigma	Pág. 6148
AlexaFluor 488 Faloidina	Tecnologias da Vida	A12379
Soro normal de cavalo	Tecnologias da Vida	Rolamento 26050-070
Frango policlonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 IgG anti-frango de cabra conjugada	Tecnologias da Vida	Rolamento A11042
NucBlue Coloração de células vivas ReadyProbes Reagente Hoescht 33342	Tecnologias da Vida	R37605
Pacote de software NIS-Elements	Instrumentos Nikon
Nikon Eclipse TE2000-E microscópio fluorescente invertido controlado por computador	Instrumentos Nikon