Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais
- Use ratos machos e fêmeas com 3 meses de idade neste estudo.
- Mantenha os animais em um ciclo claro/escuro de 12 horas com livre acesso a comida e água.
2. Preparação do coquetel KAX (cetamina + xilazina + acepromazina) para anestesia animal
- Dissolver 50 mg de xilazina (20 mg/ml) em 5 ml de cetamina (100 mg/ml) com 1 ml de acepromazina (10 mg/ml) e 3 ml de água destilada. Homogeneizar.
- Esterilize com um filtro de seringa e guarde esta solução em um frasco de soro de 10 ml.
3. Injeção KAX
- Pesar o animal (g) e voltar à gaiola até estar pronto para a injeção.
- Injectar 0,1 ml de KAX/100 g de peso corporal por via intraperitoneal, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 28 G.
- Permita que o animal fique inconsciente. Verifique os reflexos beliscando os pés e a cauda.
- Mantenha todos os animais em segurança no laboratório durante a cirurgia.
- Após a cirurgia, substitua os animais em suas gaiolas e mantenha-se confortável em temperatura ambiente (TR) até que a consciência seja recuperada. Só devolva os animais ao biotério quando eles acordarem e retomarem o comportamento normal.
4. Preparação para Cirurgia e Montagem de Microagulhas
- Faça uma solução estéril de NaCl 2 M.
- Use um extrator de microeletrodo (Figura 1C) para puxar um tubo de borossilicato de parede fina e padrão polido pesado de 0.86 mm de diâmetro interno em duas microagulhas de vidro finamente cônicas (Figura 1D, Figura 1E).
- Preencha uma microagulha da etapa anterior com solução salina 2 M usando uma agulha de seringa de enchimento e uma seringa de 1 ml (Figura 1B). Retire as bolhas de ar da ponta do eletrodo.
- Encha uma segunda seringa de 1 ml com NaCl 2 M. Conecte uma agulha de 18 G e, em seguida, prenda um comprimento (aproximadamente 10 polegadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Use o êmbolo da seringa para encher o tubo de polietileno com solução salina através da agulha.
- Quando a microagulha e o tubo estiverem cheios de solução salina, conecte cuidadosamente os dois. Elimine qualquer ar na conexão entre eles (Figura 2).
- Chanfre finamente a ponta da microagulha raspando-a levemente contra o grão de uma toalha de papel.
- Verifique a resistência da microagulha empurrando suavemente o êmbolo na seringa até que um fluxo fino de líquido possa ser visto na toalha de papel. O fluxo de líquido não deve ser maior que 0.5 mm.
5. Preparação do Animal
- Aplique 1 - 2 gotas de anestésico tópico na córnea (solução oftálmica de cloridrato de proparacaína, USP, 0,5%). Aguarde até que não ocorra reflexo ocular.
- Apare os bigodes com uma tesoura.
- Sature um aplicador de ponta de algodão com solução de betadine e esfregue a área ao redor do olho experimental.
- Usando um microscópio, conecte um hemostático para prender a pálpebra inferior para abaular o olho, expor a veia episcleral e restringir o movimento dos olhos. (Figura 3, ponta de seta)
6. Injeção salina indutora de glaucoma
- Quando o conjunto da microagulha e o animal estiverem preparados, inicie as injeções.
- Quando for confirmado que o animal não responde ao beliscão dos pés/cauda, perfure cuidadosamente a veia episcleral com a microagulha, fazendo um ângulo baixo entre 10 e 20 graus em relação à veia (Figura 3, seta branca). Uma punção bem-sucedida na veia é aparente quando o sangue entra na ponta da microagulha (Figura 3, seta preta).
- Injete lenta e manualmente aproximadamente 50 μl de solução salina na veia. Isso deve levar aproximadamente 10 segundos. As veias ficarão brancas à medida que o sal circula pela vasculatura (Figura 4, ponta de seta). Algumas regiões podem manter uma aparência vermelho-sangue (Figura 4, seta).
- Realize uma segunda injeção na veia, oposta ao local da primeira, para garantir danos retinianos completos a toda a camada de células ganglionares da retina.
Nota: Em poucos minutos, deve-se ver uma aparência turva distinta através da íris do olho à medida que o sal circula pelo sistema vascular.
- Deixe o olho oposto sem tratamento para uso como controle interno.
