Isolamento de fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral

Resumo

Fonte: Upadhyay, A. et al., Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibrilas Amilóides do Cérebro. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o protocolo para isolar fibrilas amilóides do extrato de tecido cerebral de camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade e digestão de proteínas não amilóides.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Colheita de tecidos e purificação de amilóide

NOTA: Idealmente, as fibrilas amilóides devem ser isoladas de regiões cerebrais recém-dissecadas. No entanto, esse método também funciona bem com tecidos cerebrais congelados ou congelados. Abaixo está um breve esboço dos tecidos cerebrais de congelamento instantâneo para armazenamento para uso posterior.

1. Coleta e armazenamento de tecido cerebral: Disseque cérebros de camundongos e colha rapidamente as regiões carregadas de amilóide (ou seja, córtex e hipocampo), seguido de congelamento instantâneo em nitrogênio líquido ou um banho de álcool com gelo seco.
   nota: O congelamento instantâneo ajuda a preservar os atributos estruturais dos constituintes do tecido. Os camundongos são eutanasiados por isoflurano e luxação cervical. É aconselhável evitar o uso de CO₂, pois isso pode comprometer a integridade do proteoma cerebral.
2. Pós-dissecção, corte e armazene tecidos frescos em pequenos blocos (por exemplo, 5 mm x 5 mm), pois isso facilita uma homogeneização mais eficiente antes da extração amiloide. Transfira o tecido para o frasco criogênico estéril, aperte sua tampa e submerja rapidamente.
3. Mantenha os tecidos congelados em condições ultrafrias (ou seja, -80 °C ou nitrogênio líquido). Se a extracção for efectuada alguns dias mais tarde, conservar os tecidos a -20 °C e evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Descongele os tecidos congelados em gelo úmido quando estiver pronto para extração e purificação.
   nota: O contato direto dos tecidos com nitrogênio líquido pode causar danos aos tecidos e proteínas. Observe que um banho de álcool pode remover marcadores permanentes dos rótulos dos tubos.

2. Enriquecimento de material insolúvel em dodecil sulfato de sódio (SDS)

NOTA: Execute todas as etapas no gelo e centrifugue a 4 °C, salvo indicação em contrário. Os fabricantes e os números de catálogo de produtos químicos e instrumentos são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Comece com regiões de tecido cerebral recém-dissecadas ou congeladas (descongeladas no gelo) colocadas em um tubo de 2 mL contendo 6-8 esferas de cerâmica e tampão de homogeneização gelado recém-preparado (1 mL para 0,25-1 g de massa de tecido úmido).
2. Transferir os tubos para o homogeneizador do moinho de esferas e triturar o conteúdo do tecido a 4000 rpm, com dois ciclos de 30 s cada e um intervalo de 30 s entre eles.
   nota: Alternativamente, sistemas agitadores ou homogeneizadores motorizados podem ser usados para moer e homogeneizar os tecidos.
3. Adicione 9 mL de tampão de homogeneização gelado a 1 mL de homogeneizado de tecido cerebral inteiro em tubos de 15 mL, sele com tiras de filme de cera de laboratório e gire de ponta a ponta durante a noite a 4 °C para garantir uma solubilização robusta.
   nota: Para remover grandes detritos celulares e lipídios indesejados, na manhã seguinte, gire os tubos a 800 x g a 4 ° C por 10 min e colete o sobrenadante em um tubo novo. Ressuspender o sedimento restante em 2 ml de tampão de homogeneização gelado, misturar bem, centrifugar novamente durante 10 min a 4 °C e combinar os dois sobrenadantes.
4. Adicione lentamente sacarose sólida à suspensão de extrato tecidual até uma concentração final de 1,2 M, misture bem e centrifugue a 250.000 x g por 45 min a 4 ° C.
5. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de homogeneização contendo 1,9 M de sacarose por trituração, seguida de centrifugação a 125.000 x g por 45 min a 4 °C.
   nota: O volume do buffer pode ser ajustado com base na quantidade de material recuperado na etapa anterior. Em geral, 10 volumes de tampão de homogeneização (V/V) são ideais para esta etapa.
6. Colete a camada sólida branca superior usando uma pipeta, transfira-a para um tubo novo e solubilize em 1 mL de tampão de lavagem gelada pipetando para cima e para baixo várias vezes, sem introduzir bolhas de ar.
7. Além da camada superior, o pellet também é enriquecido com fibrilas amilóides. Para um rendimento maior, combine as duas frações e prossiga. Remova cuidadosamente a camada aquosa intermediária usando uma pipeta e descarte.
8. Centrifugar as fracções combinadas a 8000 x g durante 20 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
9. Adicione 1 mL de tampão de digestão gelada ao pellet lavado, ressuspenda e incube em temperatura ambiente (RT) por 3 h.
10. Centrifugar a 8000 x g durante 20 min a 4 °C e retirar o sobrenadante com uma pipeta.
11. Ressuspenda e lave (o mesmo que na Etapa 2.8.) o pellet digerido duas vezes em 1 mL de tampão Tris gelado.
12. Ressuspenda o pellet lavado em 1 mL de tampão de solubilização contendo 1% de SDS e 1,3 M de sacarose pipetando para cima e para baixo. Centrifugue rapidamente a 200.000 x g por 60 min a 4 °C.
    nota: Embora as fibrilas amilóides sejam altamente resistentes a detergentes e desnaturantes, exposições muito longas ao detergente (SDS a 1%) podem afetar a integridade das fibrilas ou remover as proteínas fortemente ligadas, o que comprometerá as análises subsequentes. Portanto, imediatamente após ressuspender os pellets, prossiga para a centrifugação.
13. Guarde o pellet e aumente o volume do sobrenadante restante adicionando tampão Tris 50 mM (na proporção de 1:0,3) para reduzir a concentração de sacarose de 1,3 para 1 M e centrifugue mais uma vez a 200.000 x g por 45 min a 4 °C.
14. Dissolva os dois pellets em 100 μL de tampão Tris contendo 0,5% de SDS e pool para purificação de amilóide. Os pellets visíveis são pequenos e devem parecer opacos e esbranquiçados (ver figura 1A).

Resultados

Figura 1: Confirmação da extração amilóide usando coloração bioquímica e imagem de fibrilas amilóides. (A) O pellet insolúvel SDS contendo amilóide enriquecido parece opaco de cor esbranquiçada. (B) Coloração com vermelho Congo do sobrenadante solúvel SDS e pellet insolúvel SDS contendo amilóide purificado borrado em membrana de nitrocelulose de 0,45 μm; As leituras ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inibição da Protease	Thermo Científico	164535	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Colagenase	Sigma-Aldrich	C0130	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Coquetel Completo de Inibidores de Protease	Sigma-Aldrich	11697498001	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Dnase I	Thermo Fisher Científico	EN0521	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Motor do sistema de homogeneização de tecidos K54	Cole Parmer	Glas-Col 099C	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Ultracentrífuga Optima L-90K	Beckman Coulter	BR-8101P-E	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Homogeneizador de tecidos Precellys 24	Instrumentos Bertin	P000062-PEVO0-A	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	Nº 74255	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Microcentrífuga Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Fisher Científico	75002446	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes
Tris-HCl	Thermo Fisher Científico	15568025	Podem ser utilizados instrumentos alternativos, produtos químicos e anticorpos de outros fabricantes