Uma injeção intracerebroventricular para analisar a distribuição do citomegalovírus murino em um cérebro de camundongo neonatal

Resumo

Fonte: Kawasaki, H., et al. Injeção Intracerebroventricular e Intravascular de Partículas Virais e Microesferas Fluorescentes no Cérebro Neonatal. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra o processo de injeção intracerebroventricular para estudar a distribuição do citomegalovírus murino (MCMV) no cérebro de camundongos neonatais. O MCMV, projetado para expressar uma proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) para visibilidade, é injetado no ventrículo lateral do cérebro de um filhote de camundongo. O vírus injetado circula pelo líquido cefalorraquidiano, infectando células na região periventricular, incluindo a zona marginal, o plexo coróide e a zona subventricular.

Protocolo

1. Injeção ICV de MCMV e Microesferas Fluorescentes em Camundongos Neonatais

1. Mantenha camundongos ICR prenhes normais em uma instalação com temperatura controlada sob um ciclo claro/escuro de 12 horas. Os neonatos são designados como P 0,5 no dia do nascimento.
2. Esterilize uma seringa de 10 μl e uma agulha de 27 G com álcool a 70%.
3. Carregue a solução injetável (5 μl) contendo MCMV ou microesferas fluorescentes na agulha, puxando cuidadosamente o êmbolo da seringa.
4. Contenha o camundongo neonatal (P 0,5) colocando o camundongo no gelo por 3 a 4 min. Quando o animal estiver sob anestesia, use o método de resposta ao beliscão do dedo do pé para determinar a profundidade da anestesia.
5. Marque o local da injeção com uma caneta de laboratório não tóxica em um local aproximadamente 0,7 - 1,0 mm lateral à sutura sagital e 0,7 - 1,0 mm caudal do bregma neonatal (Figura 1A).
6. Insira a agulha com 2 mm de profundidade, perpendicular à superfície do crânio no local de injeção marcado. Para referência, marque a 2 mm da ponta da agulha com um fabricante não tóxico.
7. Injete lentamente 5 μl de MCMV (aproximadamente 5 × 10⁵ PFU) no ventrículo lateral sem abrir o couro cabeludo (Figura 1B).
8. Em outro grupo de camundongos, injete uma solução de 5 μl contendo microesferas fluorescentes (0,1 - 0,3 μm, aproximadamente 5,75 × 10⁸ partículas) pelo mesmo método.
9. Remova lentamente a agulha 10 - 20 segundos após interromper o movimento do êmbolo para evitar o refluxo.
10. Para se recuperar, mantenha os ratos por 5 a 10 minutos em um recipiente quente até que o movimento e a capacidade de resposta geral sejam restaurados.
11. Colha os cérebros em vários pontos de tempo (3, 12, 24, 48 e 72 horas) após a injeção.

Resultados

Figura 1: Locais de injeção do camundongo neonatal. (A, B) Injeção ICV de 5 μl MCMV (aproximadamente 5 × 10⁵ PFU) ou de 5 μl de microesferas (aproximadamente 5,75 × 10⁹ partículas). (A) O local da injeção está no ponto médio entre a orelha e o olho (em um local aproximadamente 0,7 - 1,0 mm lateral à sutura sagital e 0,7 - 1,0 mm caudal do bregma neonatal).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Vermelho Nilo 0,04-0,06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Vermelho Nilo 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Poliestireno Fluorescente Vermelho Nilo 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% de soro de camundongo	DAKO	X0910
Mouse C57BL/6	SLC, Inc.
Mouse ICR	SLC, Inc.
Seringas de microlitros modificados (série 7000)	Empresa Hamilton
Agulha de calibre 35	Saito Médico
vetor pEGFP-N1	Clontech	#6085-1