Avaliação da resposta interneuronal a pistas quimioatras de células endoteliais periventriculares

Resumo

Fonte: Datta, D., et al. Ensaios de migração, quimioatração e co-cultura para células-tronco humanas derivadas de células-tronco endoteliais e neurônios GABAérgicos. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo mostra um método para testar a migração de interneurônios em resposta a pistas quimioatrativas de células endoteliais periventriculares (PVECs). Os interneurônios são colocados em um compartimento central, com PVECs e células de controle em ambos os lados. O aumento da migração para PVECs indica uma resposta positiva aos seus sinais quimioatraentes.

Protocolo

1. Ensaio de Atração Quimiológica

1. Coloque uma inserção de cultura de três poços no centro de uma placa de 35 mm revestida com poli-L-ornitina/laminina usando uma pinça estéril.
2. Vire o prato de cabeça para baixo. Marque o limite ao redor do compartimento central do inserto usando um marcador preto permanente com uma ponta ultrafina.
3. Semeie 3 x 10⁴ interneurônios GABAérgicos humanos no compartimento do meio em 70 μL de meio neuronal (Figura 1A).
4. Semear 10⁴ células endoteliais periventriculares humanas em 70 μL de meio de células endoteliais periventriculares e 10⁴ células endoteliais de controle em 70 μL de meio de células endoteliais de controle nos dois compartimentos externos, respectivamente (Figura 1A).
5. Adicione 1 mL de meio de cocultura (50% de meio de manutenção periventricular sem GABA e 50% de meio neuronal) ao longo da lateral da placa para evitar que o revestimento da placa seque.
6. Verifique ao microscópio se as células não estão vazando do compartimento de inserção.
7. Incubar as células durante 24 h a 37 °C e 5% de CO₂. Após 24 horas de incubação, verificar ao microscópio se as células se fixaram correctamente e se não há fugas.
8. Após 48 h de semeadura, remova cuidadosamente o inserto usando uma pinça estéril. Verifique ao microscópio se a camada celular não está perturbada (dia 0).
9. Remova o meio e adicione 1 mL de meio de co-cultura fresco.
   NOTA: Reserve um número necessário de pratos para as imagens do dia 0.
10. Incubar as células durante 36 h a 37 °C e 5% de CO₂. Após 36 h, aspirar o meio, fixar as células com 4% de PFA por 10 min e lavar 3x com 1x PBS.
11. Corar interneurônios GABAérgicos humanos com anticorpo anti-β-tubulina humana ou anticorpo MAP2 anti-humano. No final do procedimento de coloração, adicione 1 mL de meio de montagem antidesbotamento a cada prato.

2. Imagem e análise de dados

1. Coloque a placa de ensaio imunocorada sob um microscópio com ampliação de 4X.
2. Mantenha uma borda longa do limite retangular (feita na etapa 5.10 acima) no campo de view. Tire imagens de células no espaço livre de células adjacente a esse limite. Adquira imagens ao longo da borda longa direita e da borda longa esquerda do limite retangular.
   NOTA: As células posicionadas diagonalmente em relação ao retângulo não são consideradas devido à ambiguidade na seleção da borda curta ou longa como marca inicial. Além disso, o número de células que migram através da borda curta costuma ser significativamente menor (possivelmente devido ao menor número de células iniciais ao longo da borda curta) e não é considerado.
3. Abra as imagens no ImageJ. Calcule a distância entre cada célula e a marca de limite usando ImageJ.
4. Para avaliar a migração em termos de números de células, defina uma distância específica do limite na imagem adquirida em ImageJ. Conte o número de células presentes dentro dessa distância. Calcular o número médio, desvio padrão
5. e significância estatística usando software apropriado.

Resultados

Figura 1: Ensaio de quimio-atração. (A) Esquema do ensaio de quimio-atração. Usando uma inserção de cultura de três poços, os interneurônios (IN) foram semeados no meio (retângulo pontilhado verde), enquanto as células endoteliais periventriculares (PV ECs; retângulo pontilhado laranja) e as células endoteliais de controle (ECs; retângulo pontilhado amarelo) foram semeadas em ambos os lados. (B) Imag...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Controle as células endoteliais humanas	Dinâmica Celular	R1022
Suplemento Médio de Células Endoteliais de Controle	Dinâmica Celular	M1019
Meio DMEMF/12	Thermofisher Científico	11320033
E6 médio	Thermofisher Científico	A1516401
FGF2	Thermofisher Científico	PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Científico	Rolamento 33016-015
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neurônios GABAérgicos humanos	Dinâmica Celular	R1013
Meio de base dos neurônios GABAérgicos humanos	Dinâmica Celular	M1010
Neurônio GABAérgico humano Suplemento neural	Dinâmica Celular	M1032
Laminina	sigma	L2020
Meio de montagem	Laboratórios de vetores	H-1200
poli-L-ornitina	sigma	pág. 4957
Pbs	Thermofisher Científico	14190
VEGF-A	Peprotech	100-20
Kit Completo VascuLife VEGF Médio	Tecnologias de células de linha de vida	LL-0003	Componente do meio de células endoteliais humanas de controle
Cultura de silicone de 3 poços - Inserção	ibidi	Nº 80369
Prato de 35 mm	Corning	430165
Solução de PFA a 4%	Fisher Científico	AAJ19943K2
Microscópio de contraste de fase invertida	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Microscópio fluorescente	Olimpo	FSX-100
Anticorpo anti-β-tubulina humana	Biolenda	802001
Anticorpo anti-MAP2	Neurômica	CH22103