Imunoprecipitação de Complexos Proteína-DNA Alvo a partir de Lisado de Neurônio Motor

Resumo

Fonte: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Mapeamento de alta resolução das interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco de camundongos usando imunoprecipitação-exonuclease da cromatina (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a imunoprecipitação de fragmentos de DNA reticulados com proteína-alvo de lisados de neurônios motores derivados de células-tronco usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos da proteína-alvo.

Protocolo

NOTA: Água destilada e deionizada autoclavada (ddH₂O) é recomendada para fazer tampões e misturas master de reação.

1. Coletando e reticulando células

1. Depois de diferenciar as células-tronco embrionárias (ES) de camundongo em neurônios pós-mitóticos, adicione 11% de formaldeído às células colhidas até uma concentração final de 1% (v / v). Células de rocha em uma plataforma de balanço (um balancim, agitador ou rotador) por 15 min, à temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   nota: Dependendo da proteína alvo a ser reticulada, pode ser usada menos reticulação de formaldeí....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose, UltraPure	Invitrogen	16500	Verificando a sonicação (Seção 4.3.6)
Albumina, Soro Bovino (BSA), Livre de Protease, Isolamento de Choque Térmico, Min. 98%	BioLoja	ALB003	Solução de bloqueio
Anticorpo contra Isl1	DSHB	39.3F7	Incuação de anticorpos com esferas (Secção 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	Cromatina Sonicante (Seção 3.3)
Centrífuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonicação da cromatina (ponto 3.5), verificação da sonicação (pontos 4.3.1, 4.3.3 e 4.3.4)
Centrífuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Células de colheita, reticulação e congelamento (Seção 1.3), Lise celular (Seção 2.2 e 2.3), Cromatina Sonicante (Seção 3.1)
Coquetel de inibidor de protease completo, mini e sem EDTA	Roche	4693159001	Adicionado a todos os tampões, exceto tampão de proteinase K e tampão de eluição ChIP
Sal de Sódio de Ácido Desoxicólico	Fisher Científico	BP349	Tampão de lise 3, tampão de lavagem com alto teor de sal e tampão de lavagem LiCl
EDTA, 0,5 M, Solução Estéril, pH 8,0	BioLoja	EDT111	Tampão de lise 1-3, verificação de sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem LiCl e tampão de eluição ChIP
Álcool etílico anidro, 100%	Álcoois comerciais	P006EAAN	Verificando a sonicação (Seção 4.3.3)
O formaldeído, 36,5-38%, contém 10-15% de metanol	sigma	Rolamento F8775	Colheita, reticulação e congelação de células (ponto 1.1)
Glicerol, grau de reagente, min 99,5%	BioLoja	GLY002	Tampão de lise 1
Glicina, Grau de Biotecnologia, min. 99%	BioLoja	GLN001	Extração, reticulação e congelação de células (ponto 1.2)
Glicogênio, grau de RNA	Thermo Científico	R0551	Verificando a sonicação (Seção 4.3.3)
HEPES, solução filtrada estéril 1 M, pH 7,3	BioLoja	HEP003	Tampão de lise 1, tampão de lavagem com alto teor de sal
Cloreto de lítio (LiCl), grau de reagente	Bioshop	LIT704	Tampão de lavagem LiCl
Grânulos magnéticos para ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (esferas magnéticas para ChIP)	Dynabeads Protein G (esferas magnéticas para ChIP)	Incubação de anticorpos com esferas (Seção 5)
Rack magnético (ímã DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Usado em muitas etapas nas seções: 5
Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina, solução aquosa a 30%, ≥97,0% (HPLC)	sigma	Nº 61747	Tampão de lise 3
Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)	BioLoja	NÃO999	Tampão de lise 1 e tampão de lavagem LiCl
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico, Grau de Biotecnologia (25: 24: 1)	BioLoja	PHE512	Verificando a sonicação (Seção 4.3.1)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Colheita, reticulação e congelamento de células (Seção 1.3) e Cromatina Sonicante (Seção 3.1), Incuação de anticorpos com esferas (Seção 5.1)
Fonte de alimentação básica PowerPac	BioRad	1645050	Verificando a sonicação (Seção 4.3.6)
Solução de proteinase K, grau de RNA	Invitrogen	25530049	Verificando a Sonicação (Seção 4.2)
Rnase A, Dnase e Protease-livre	Thermo Científico	EN0531	Verificando a sonicação (Seção 4.3.2)
Cloreto de sódio (NaCl), BioReagent	sigma	S5886	Tampão de lise 1-3, tampão de lavagem com alto teor de sal
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Grau de Eletroforese	BioLoja	SDS001	Verificando a sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem com alto teor de sal e tampão de eluição ChIP
Contas de sonicação e tubos de bioruptor de 15 mL	Diagenode	C01020031	Cromatina Sonicante (Pontos 3.1 e 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Seção 4.2, 4.3.2 e 4.3.5
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 7,4	sigma	T2194	Tampão Tris-HCl de 10 mM
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), com certificação BioPerformance, 1 M, pH 8,0	sigma	T2694	Tampão de lise 2, tampão de lise 3, verificação de sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem LiCl e tampão de eluição ChIP
VWR Mini balancim tubular, velocidade variável	VWR	Rolamento 10159-752	Usado em muitas etapas nas seções: 1, 2, 5, 6 e 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100, grau de reagente	BioLoja	TRX506	Tampão de lise 1, cromatina sonicante (Seção 3.4) e tampão de lavagem com alto teor de sal