Imunoprecipitação de Complexos Proteína-DNA Alvo a partir de Lisado de Neurônio Motor

Resumo

Fonte: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. Mapeamento de alta resolução das interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco de camundongos usando imunoprecipitação-exonuclease da cromatina (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a imunoprecipitação de fragmentos de DNA reticulados com proteína-alvo de lisados de neurônios motores derivados de células-tronco usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos da proteína-alvo.

Protocolo

NOTA: Água destilada e deionizada autoclavada (ddH₂O) é recomendada para fazer tampões e misturas master de reação.

1. Coletando e reticulando células

1. Depois de diferenciar as células-tronco embrionárias (ES) de camundongo em neurônios pós-mitóticos, adicione 11% de formaldeído às células colhidas até uma concentração final de 1% (v / v). Células de rocha em uma plataforma de balanço (um balancim, agitador ou rotador) por 15 min, à temperatura ambiente (RT, 25 °C).
   nota: Dependendo da proteína alvo a ser reticulada, pode ser usada menos reticulação de formaldeído (por exemplo, uma concentração final de 0,5%) ou reticulação dupla com glutarato de disuccinimidil (DSG).
2. Adicione 2,5 M de glicina a uma concentração final de 150 mM para interromper a reação de reticulação. Células de rocha em uma plataforma de balanço em RT, por 5 min.
3. Centrifugue as células reticuladas em tubos cônicos de 15 mL em RT, por 6 min, a 1.350 x g. Aspire a solução e, em seguida, ressuspenda as células em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
   nota: Os pellets de células reticuladas podem ser armazenados a -80 °C após congelamento instantâneo com nitrogênio líquido.

2. Lise celular

NOTA: As etapas a seguir neste protocolo são para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronais diferenciadas de células ES de camundongo. Para quebrar as células abertas, serão usados tampões de lise contendo vários detergentes. Adicione 50 μL de estoque de inibidor de protease completo (CPI) 1000x a 50 mL de tampão antes do uso.

1. Prepare os tampões de lise 1−3 conforme descrito na Tabela 1.
2. Descongele os grânulos de células reticuladas no gelo e, em seguida, ressuspenda completamente os grânulos de células em 3 mL de tampão de lise 1 em tubos cônicos de 15 mL. Balance a 4 °C por 15 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar sobrenadante.
3. Ressuspenda completamente as células peletizadas em 3 mL de tampão de lise 2. Balance a 4 °C por 10 min em uma plataforma de balanço. Centrifugar a 1.350 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar sobrenadante.
4. Adicione 1 mL de tampão de lise 3 a cada pellet e mantenha no gelo. Proceda imediatamente à sonicação.

3. Cromatina sonicante

NOTA: Mantenha as amostras no gelo ou a 4 °C durante este procedimento de sonicação para reduzir a reversão da reticulação.

1. Usando uma espátula estéril, adicione grânulos de sonicação (Tabela de Materiais) até a marca de graduação de 0,2 mL em tubos de poliestireno de 15 mL. Lave os grânulos de sonicação por vórtice em 600 μL de 1x PBS até que nenhum ponto seco seja visível. Centrifugue os tubos por 5 s a 30 x g e aspire 1x PBS.
   nota: A sonicação em tubos de poliestireno é mais eficiente do que a sonicação em tubos de polipropileno. Se um número menor de células (por exemplo, <10⁶ células) for sonicado, use tubos de poliestireno de 1,5 mL sem adicionar esferas de sonicação.
2. Ressuspenda completamente os lisados nucleares em 1 mL de tampão de lise 3 (da etapa 2.4) e, em seguida, transfira para os tubos de poliestireno de 15 mL contendo esferas de sonicação. Um breve vórtice dos tubos de poliestireno.
3. Para fragmentar o DNA da cromatina reticulada, sonicar lisados nucleares a 4 °C por um número otimizado de ciclos, com amplitude de potência de 30 W e ciclos de sonicação definidos para 30 s ligado/30 s desligado.
   nota: A otimização da sonicação para cada tipo de célula e lote resultará no melhor rendimento de imunoprecipitação-exonuclease da cromatina (ChIP-exo). Para 2 x 10⁷ células neuronais de camundongo, 20-30 ciclos de sonicação nas configurações mencionadas fragmentarão a cromatina na faixa de 100-500 pb.
4. Após a conclusão da sonicação, transfira todo o sobrenadante (lisados sonicados), de cada amostra, para tubos de 1,5 mL. Adicionar 10% de 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol) a cada amostra a uma concentração final de 1%. Misture por pipetagem.
5. Para sedimentar os detritos das células, centrifugue as amostras a 13.500 x g durante 10 min a 4 °C. Transfira todos os lisados sonicados (sobrenadantes) de cada amostra para novos tubos de 1,5 ml.
6. Pegue 30 μL de lisado sonicado de cada amostra (~ 3% de lisado sonicado) e adicione a novos tubos de 1,5 mL para verificar a sonicação. Conservar os restantes lisados sonicados a 4 °C até estarem prontos para incubação com esferas revestidas com anticorpos.

4. Verificando a sonicação

1. Faça 20 mL de tampão 2x proteinase K adicionando 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), 2 mL de ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) 0,5 M, 10 mL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS) e 6 mL de ddH₂O autoclavado. Não adicione CPI a esse buffer. Conservar em tubo de 50 ml à RT.
2. Para reverter a reticulação proteína-DNA, removendo as proteínas, pegue os 30 μL de cromatina sonicada de cada amostra (da etapa 3.6), adicione 166 μL de ddH₂O autoclavado, 200 μL de tampão 2x proteinase K e 4 μL de 20 mg / mL de proteinase K. Agite brevemente as amostras em vórtice e, em seguida, incube a 65 ° C por 1−3 h a 24 x g.
3. NOTA: Os lisados sonicados podem ser reticulados reversos a 65 °C durante a noite.
4. Extrair DNA usando fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (PCIA: 25:24:1) e método de precipitação de etanol da seguinte forma.
   cuidado: O PCIA é tóxico. Use sob uma hotte com equipamento de proteção individual (EPI) padrão.
   1. Adicione 400 μL de PCIA a cada amostra em tubos de 1,5 mL, ajuste o vórtice para a velocidade máxima e amostras de vórtice por 20 s. Centrifugue a 18.400 x g por 6 min em RT. Duas fases serão observadas. Transfira cuidadosamente a camada aquosa superior (fase clara) de cada amostra para novos tubos de 1,5 mL.
   2. Adicionar 1 μL de 10 mg/ml de RNase A. Incubar as amostras a 37 °C durante 30 min.
   3. Adicione 1 μL de glicogênio 20 mg / mL a cada amostra e, em seguida, precipite com 1 mL de etanol 100% gelado (armazenado em um freezer a -20 ° C). Misture brevemente e, em seguida, incube as amostras no freezer a -80 °C por 30 min a 1 h. Centrifugue amostras a 18.400 x g por 10 min a 4 °C e despeje cuidadosamente etanol 100%.
   4. Lave os pellets com 500 μL de etanol a 70% gelado (armazenado em um freezer a -20 °C). Centrifugue a 18.400 x g por 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente etanol a 70%.
   5. Incubar as amostras em tubos de 1,5 ml a 50 °C até evaporar o etanol restante. Ressuspenda os grânulos de DNA em 15 μL de ddH2O autoclavado ou ddH2O livre de nuclease.
   6. Execute as amostras de DNA extraídas, juntamente com uma escada de DNA, em um gel de agarose a 1,5% a 120-180 V e verifique o tamanho do DNA sonicado.

5. Incubação de anticorpos com esferas

NOTA: As etapas a seguir neste protocolo são para aproximadamente 2 x 10⁷ células neuronais diferenciadas de células ES de camundongo. Não congele e descongele as esferas magnéticas em nenhum momento durante o protocolo ChIP-exo, pois as esferas podem rachar, causando contaminação da amostra ou o desempenho do anticorpo pode ser comprometido.

1. Após a lise celular e sonicação, prepare grânulos magnéticos de proteína G (Tabela de Materiais) para ChIP, misture grânulos magnéticos até ficar homogêneo e, em seguida, adicione 25 μL de grânulos magnéticos a 2 mL de tubos de baixa ligação de proteína.
   NOTA: O tipo de esferas magnéticas usadas dependerá da espécie dos anticorpos.
2. Lave as esferas com 1 mL de solução bloqueadora (Tabela 1), misture bem e coloque em uma grade magnética por 1 min. Ainda em um rack magnético, remova o sobrenadante assim que estiver claro.
3. Adicione 1 mL de solução de bloqueio aos grânulos magnéticos. Tubos de rocha por 10 min a 4 °C em uma plataforma de balanço. Gire brevemente, coloque os tubos em um rack magnético e remova o sobrenadante.
4. Repita a etapa 5.3 mais duas vezes.
5. Adicione 500 μL de solução de bloqueio aos grânulos magnéticos. Gire brevemente o anticorpo contra Isl1 (0,04 μg / μL, Tabela de Materiais) e, em seguida, adicione 4 μg de anticorpo aos tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL correspondentes contendo os grânulos magnéticos na solução de bloqueio.
6. Repita a etapa 5.5 sem anticorpos (ou seja, o controle sem anticorpos para ChIP).
   nota: A quantidade de anticorpo a ser adicionada pode ser determinada empiricamente considerando a qualidade do anticorpo e o número de células usadas para ChIP.
7. Amostras de rocha a 4 ° C por 6−24 h em uma plataforma de balanço.

6. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

1. Lave os grânulos revestidos com anticorpos da etapa 5.8 com 1 mL de solução de bloqueio. Colocar as amostras numa plataforma de baloiço a 4 °C durante 5 min. Remover o sobrenadante.
2. Repita a etapa 6.1 mais duas vezes.
3. Ressuspenda os grânulos revestidos com anticorpos em 50 μL de solução de bloqueio e, em seguida, transfira para novos tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL. Para cada amostra de ChIP, adicione lisados sonicados (~ 1,0 mL da etapa 3.6) a grânulos revestidos com anticorpos em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL.
4. Incubar cada amostra numa plataforma de baloiço durante a noite a 4 °C.

7. Lavagens ChIP

NOTA: Mantenha as amostras no gelo ou a 4 °C para manter a reticulação proteína-DNA durante as lavagens com ChIP.

1. Faça tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem LiCl e tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) conforme descrito na Tabela 2. Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque de 1000x CPI a todos os tampões antes de usar.
2. Gire brevemente as amostras em tubos de baixa ligação de proteína de 2 mL para coletar o líquido das tampas, depois coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta.
3. Para lavagens com ChIP, adicione 1 mL de tampão de lise 3 (a 4 °C) a cada tubo. Misturar numa plataforma de baloiço a 4 °C durante 5 min. Gire brevemente as amostras, coloque em um rack magnético por 1 minuto e remova o sobrenadante com uma pipeta.
4. Adicione 1 mL de tampão de lavagem frio com alto teor de sal a cada tubo. Misturar numa plataforma de baloiço a 4 °C durante 5 min. Gire brevemente as amostras, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante com uma pipeta.
5. Adicione 1 mL de tampão de lavagem LiCl frio a cada tubo. Misturar numa plataforma de baloiço a 4 °C durante 5 min. Gire brevemente as amostras, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante com uma pipeta.
6. Adicione 1 mL de tampão Tris-HCl frio 10 mM (pH 7,4) a cada tubo. Misturar numa plataforma de baloiço a 4 °C durante 5 min. Gire brevemente as amostras, coloque em um rack magnético por 1 min e remova o sobrenadante com uma pipeta.
   nota: O tampão Tris-EDTA (pH 8,0) pode ser usado em vez do tampão Tris-HCl (pH 7,4).

Tabela 1: Receitas para tampões de lise 1−3 e tampão de bloqueio. Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque 1000x CPI (inibidor completo de protease) a todos os tampões antes de usar.

Tampão de lise 1
Reagente	Volume (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	1.4	140 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
50% de glicerol	10	10% de sucesso
10% de etoxilato de octilfenol	2.5	0,50%
10% de 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol	1.25	0,25%
Autoclavado ddH2O	Encher até 50
Tampão de lise 2
Reagente	Volume (mL)	[Final]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	1	10 mM
5 M NaCl	algarismo	200 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
Autoclavado ddH2O	Encher até 50
Tampão de lise 3
Reagente	Volume (mL)	[Final]
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	0,5	10 mM
5 M NaCl	1	100 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% de ácido desoxicólico	0,5	0,10%
Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina a 30%	0,83	0,50%
Autoclavado ddH2O	Encher até 50
Solução de bloqueio
Reagente	quantidade	[Final]
Albumina de soro bovino (BSA)	250 mg	0,50%
Inibidor de Protease Completo (CPI, 1000x)	50 μL	1x
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Encha até 50 mL

Tabela 2: Receitas para lavagens ChIP: Tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão LiCl Wash e tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). Armazene em tubos de 50 mL a 4 °C. Adicione 50 μL de estoque de 1000x CPI a todos os tampões antes de usar.

Tampão de lavagem com alto teor de sal
Reagente	Volume (mL)	[Final]
1 M HEPES (pH 7,3)	2.5	50 mM
5 M NaCl	5	500 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
10% de 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol	5	1% de sucesso
5% de ácido desoxicólico	1	0,10%
5% de SDS	1	0,10%
Autoclavado ddH2O	Encher até 50
LiCl tampão de lavagem
Reagente	Volume (mL)	[Final]
0,5 M Tris-HCl (pH 8,0)	algarismo	20 mM
0,5 M EDTA (pH 8,0)	0,1	1 mM
1 M LiCl	12.5	250 mM
10% de etoxilato de octilfenol	2.5	0,50%
5% de ácido desoxicólico	5	0,50%
Autoclavado ddH2O	Encher até 50
10 mM Tris-HCl tampão
Reagente	Volume (mL)	[Final]
1 M Tris-HCl (pH 7,4)	0,5	10 mM
Autoclavado ddH2O	Encher até 50

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose, UltraPure	Invitrogen	16500	Verificando a sonicação (Seção 4.3.6)
Albumina, Soro Bovino (BSA), Livre de Protease, Isolamento de Choque Térmico, Min. 98%	BioLoja	ALB003	Solução de bloqueio
Anticorpo contra Isl1	DSHB	39.3F7	Incuação de anticorpos com esferas (Secção 5.6)
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060010	Cromatina Sonicante (Seção 3.3)
Centrífuga 5424 R	Eppendorf	5404000138	Sonicação da cromatina (ponto 3.5), verificação da sonicação (pontos 4.3.1, 4.3.3 e 4.3.4)
Centrífuga 5804 R	Eppendorf	22623508	Células de colheita, reticulação e congelamento (Seção 1.3), Lise celular (Seção 2.2 e 2.3), Cromatina Sonicante (Seção 3.1)
Coquetel de inibidor de protease completo, mini e sem EDTA	Roche	4693159001	Adicionado a todos os tampões, exceto tampão de proteinase K e tampão de eluição ChIP
Sal de Sódio de Ácido Desoxicólico	Fisher Científico	BP349	Tampão de lise 3, tampão de lavagem com alto teor de sal e tampão de lavagem LiCl
EDTA, 0,5 M, Solução Estéril, pH 8,0	BioLoja	EDT111	Tampão de lise 1-3, verificação de sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem com alto teor de sal, tampão de lavagem LiCl e tampão de eluição ChIP
Álcool etílico anidro, 100%	Álcoois comerciais	P006EAAN	Verificando a sonicação (Seção 4.3.3)
O formaldeído, 36,5-38%, contém 10-15% de metanol	sigma	Rolamento F8775	Colheita, reticulação e congelação de células (ponto 1.1)
Glicerol, grau de reagente, min 99,5%	BioLoja	GLY002	Tampão de lise 1
Glicina, Grau de Biotecnologia, min. 99%	BioLoja	GLN001	Extração, reticulação e congelação de células (ponto 1.2)
Glicogênio, grau de RNA	Thermo Científico	R0551	Verificando a sonicação (Seção 4.3.3)
HEPES, solução filtrada estéril 1 M, pH 7,3	BioLoja	HEP003	Tampão de lise 1, tampão de lavagem com alto teor de sal
Cloreto de lítio (LiCl), grau de reagente	Bioshop	LIT704	Tampão de lavagem LiCl
Grânulos magnéticos para ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (esferas magnéticas para ChIP)	Dynabeads Protein G (esferas magnéticas para ChIP)	Incubação de anticorpos com esferas (Seção 5)
Rack magnético (ímã DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Usado em muitas etapas nas seções: 5
Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina, solução aquosa a 30%, ≥97,0% (HPLC)	sigma	Nº 61747	Tampão de lise 3
Etoxilato de octilfenol (IGEPAL CA630)	BioLoja	NÃO999	Tampão de lise 1 e tampão de lavagem LiCl
Fenol: Clorofórmio: Álcool Isoamílico, Grau de Biotecnologia (25: 24: 1)	BioLoja	PHE512	Verificando a sonicação (Seção 4.3.1)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x	Corning	21040CV	Colheita, reticulação e congelamento de células (Seção 1.3) e Cromatina Sonicante (Seção 3.1), Incuação de anticorpos com esferas (Seção 5.1)
Fonte de alimentação básica PowerPac	BioRad	1645050	Verificando a sonicação (Seção 4.3.6)
Solução de proteinase K, grau de RNA	Invitrogen	25530049	Verificando a Sonicação (Seção 4.2)
Rnase A, Dnase e Protease-livre	Thermo Científico	EN0531	Verificando a sonicação (Seção 4.3.2)
Cloreto de sódio (NaCl), BioReagent	sigma	S5886	Tampão de lise 1-3, tampão de lavagem com alto teor de sal
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), Grau de Eletroforese	BioLoja	SDS001	Verificando a sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem com alto teor de sal e tampão de eluição ChIP
Contas de sonicação e tubos de bioruptor de 15 mL	Diagenode	C01020031	Cromatina Sonicante (Pontos 3.1 e 3.2)
ThermoMixer F1.5	Eppendorf	5384000020	Seção 4.2, 4.3.2 e 4.3.5
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), Certificado BioPerformance, 1 M, pH 7,4	sigma	T2194	Tampão Tris-HCl de 10 mM
Solução de cloridrato de Trizma (Tris-HCl), com certificação BioPerformance, 1 M, pH 8,0	sigma	T2694	Tampão de lise 2, tampão de lise 3, verificação de sonicação (Seção 4.1), tampão de lavagem LiCl e tampão de eluição ChIP
VWR Mini balancim tubular, velocidade variável	VWR	Rolamento 10159-752	Usado em muitas etapas nas seções: 1, 2, 5, 6 e 7
2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoxi]etanol, Triton X-100, grau de reagente	BioLoja	TRX506	Tampão de lise 1, cromatina sonicante (Seção 3.4) e tampão de lavagem com alto teor de sal