Imunomarcação de fluorescência de fatias organoides cerebelares

Resumo

Fonte: Silva, T. P., et al., Geração escalável de organoides cerebelares maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunocoloração. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de fatias organoides cerebelares para identificar antígenos-alvo específicos expressos em vários neurônios cerebelares, que são indicativos de maturação organoide.

Protocolo

1. Imunomarcação de fatias organoides

1. Coloque as lâminas do microscópio contendo seções organoides em um frasco de copling com 50 mL de PBS 1x pré-aquecido, segurando até 10 lâminas consecutivas.
   nota: Todas as seções organoides devem ser submersas em líquido.
2. Incube por 45 min a 37 °C para desgelatinizar as lâminas.
3. Lave 1x com 50 mL de PBS 1× por 5 min em RT: Transfira as lâminas para um frasco contendo PBS 1× fresco.
4. Transfira as lâminas para um frasco contendo 50 mL de glicina recém-preparada (Tabela 1) e incube por 10 min em RT.
5. Transfira as lâminas para um frasco contendo 50 mL de triton a 0,1% (Tabela 1) e permeabilize por 10 min em RT.
6. Lave com 1× PBS por 5 min 2x.
7. Preparar a placa de imunocoloração com papel de 3 mm embebido em PBS a 1×. Seque as lâminas com lenço de papel à volta das fatias e coloque-as sobre papel de 3 mm. Com uma pipeta Pasteur, cobrir toda a superfície das lâminas com uma solução de bloqueio (Tabela 1), 0,5 mL por lâmina. Incubar por 30 min em RT.
8. Remova o excesso de solução de bloqueio e seque as lâminas com um lenço de papel ao redor das fatias. Coloque 50 μL do anticorpo primário (Tabela 2) diluído em solução de bloqueio sobre as seções e cubra com as lamínulas. Coloque as fatias em uma placa de imunocoloração previamente preparada. Incubar durante a noite a 4 °C.
9. Transfira as lâminas para um frasco de copling com 50 mL de TBST (Tabela 1), deixe as lamínulas caírem e lave com TBST por 5 min 3x.
10. Colocar 50 μL do anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio sobre as secções e cobrir com as lamínulas. Coloque as fatias na placa de imunocoloração previamente preparada. Incubar por 30 min em RT, protegido da luz.
11. Transfira as lâminas para um frasco de copling novamente e lave com 50 mL de TBST por 5 min 3x.
12. Seque as lâminas com lenço de papel ao redor das fatias e coloque-as em uma placa de imunocoloração previamente preparada. Com uma pipeta de Pasteur, adicione 0,5 mL de solução de DAPI em toda a superfície das lâminas. Incube por 5 min em RT.
13. Repita a etapa 1.9.
14. Seque cuidadosamente as lâminas com um lenço de papel. Adicione 50 μL de meio de montagem gota a gota ao longo da lâmina e, em seguida, abaixe cuidadosamente uma lamínula em cada lâmina, dobrando-a levemente para evitar bolhas.

Tabela 1: Soluções para preparação de organoides para criossecção e imunocoloração. Estão listados todos os componentes e volumes utilizados para preparar as soluções utilizadas na preparação de organoides para criossecção e imunocoloração.

Gelatina/Sacarose Concentração final: 7,5%/15% p/p	1. Pese 15 g de sacarose e 7,5 g de gelatina em um frasco de vidro Schott estéril e misture bem 2. Pré-aqueça o PBS 1x a 65 °C 3. Adicione PBS pré-aquecido 1x a um peso final de 100 g e misture bem 4. Coloque a garrafa de vidro Schott em uma placa de aquecimento a 65 °C e agite até a gelatina derreter 5. Incubar a 37 °C até que a solução estabilize
Glicina Concentração final: 0,1 M	Adicione 0,37 g de glicina a 50 mL de PBS 1x recém-preparado.
Solução Triton Concentração final: 0,1 % p/v	1. Prepare um estoque de Triton X-100 a 10%: 5 g de Triton X-100 em 50 mL de PBS 1x 2. Adicione 0,5 mL de estoque Triton X-100 a 50 mL de PBS 1x.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05% p/v Tween-20	20 mL Tris 1 M 30 mL de NaCl 5 M 5 mL de Tween-20 (10 % de estoque: 5 g de Tween-20 em 50 mL de água) Encha até 1 L com água.
Solução de bloqueio	Adicionar 5 ml de soro fetal bovino (FBS, concentração final: 10 % v/v) a 50 ml de TBST.
Solução DAPI	Adicionar 15 μL de solução-mãe DAPI (1 mg/ml) a 10 ml de água destilada
Mowiol	1. Adicione 2,4 g de Mowiol a 6 g de glicerol e agite durante 1 h numa placa pré-aquecida a 50 °C 2. Adicione 6 mL de água destilada e agite por 2 h 3. Adicione 12 mL de Tris 200 mM (pH 8,5) e agite por 10 min 4. Centrifugue a 5.000 × g por 15 min5. Alíquota e conservar a -20 °C.

Tabela 2: Anticorpos primários. Os anticorpos primários, clones e diluições otimizadas usados para imunocoloração são listados.

anticorpo	Espécies hospedeiras	diluição
BARHL1	coelho	1/500
CALBINDINA	coelho	1/500
MAP2	rato	1/1000
N-CADHERIN	rato	1/1000
NESTIN	rato	1/400
OLIG2	coelho	1/500
PAX6	coelho	1/400
SOX2	rato	1/200
TBR1	coelho	1/200
TBR2	coelho	1/200
TUJ1	rato	1/1000

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
papel de 3MM	WHA3030861	Merck
Anticorpo anti-BARHL1	HPA004809	Atlas Anticorpos e Produtos relacionados
Anticorpo anti-Calbindina D-28k	CB28	Millipore
Anticorpo anti-MAP2	M4403	sigma
Anticorpo anti-N-caderina	610921	Transdução BD
Anticorpo anti-NESTIN	MAB1259-SP	R&d
Anticorpo anti-OLIG2	MABN50	Millipore
Anticorpo anti-PAX6	PRB-278P	Covance
Anticorpo anti-SOX2	MAB2018	R&d
Anticorpo anti-TBR1	AB2261	Millipore
Anticorpo anti-TBR2	AB183991	Abcam
Anticorpo anti-TUJ1	801213	Biolenda
Lamínulas 24x60mm	Nº 631-1575	VWR
DAPI	10236276001	sigma
Soro fetal bovino	A3840001	ThermoFisher
Gelatina de pele bovina	G9391	sigma
Frasco de vidro Copling	E94	ThermoFisher
glicina	MB014001	NZYtech
Monotioglicerol	M6154	sigma
Mowiol	475904	Millipore	Meio de montagem
Tritão X-100	9002-93-1	sigma
Interpolação-20	Pág. 1379	sigma
Lâminas de microscópio SuperFrost	12372098	ThermoFisher	Lâminas de microscópio de adesão