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1. Criação de Organoides Cerebrais a partir da Cultura 2D iPSC / hESC (Dia 0)
Nota: Este protocolo pressupõe que a manutenção de células-tronco (SC) seja realizada em meios de manutenção de células-tronco livres de xeno (SCMM) com um substrato de vitronectina ou Geltrex. Se estiver usando um meio alternativo de cultura de células-tronco com alto teor de proteína, é aconselhável fazer a transição das culturas SC para SCMM por pelo menos duas passagens antes de iniciar a formação do organoide. O protocolo não foi testado com métodos de cultura SC baseados em alimentador.
- Usando métodos regulares de manutenção de SC, leve as culturas a 50% -70% de confluência. Isso geralmente ocorre de 3 a 4 dias após a passagem, embora isso possa depender do método de cultura e da linhagem celular.
nota: Aproximadamente 2 poços de uma placa de 6 poços são necessários para produzir uma placa completa de 96 poços de organoides.
- Inspecione as culturas por meio de microscopia de campo claro com ampliação de 10X-20X para garantir a morfologia saudável da colônia, sem diferenciação detectável.
- Leve o SCMM a 37 ° C em banho-maria quente e descongele um frasco de 50 μL de 50 mM Y-27632 (inibidor de rocha) e 2 mL de reagente de descolamento enzimático à temperatura ambiente.
- Prepare uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa (ULA), uma pipeta P200 multicanal e um reservatório de reagente de 25 mL.
- Alíquota de 45 mL de SCMM em um tubo cônico de 50 mL e adicione 45 μL de 50 mM Y-27632. Misture bem triturando.
- Aspire a vácuo os dois poços contendo SCs e adicione rapidamente 1 mL de reagente de desprendimento livre de enzimas a cada poço usando uma pipeta P1000. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C durante 4 min.
- Aspire a vácuo os poços tratados e adicione 1 mL de reagente de descolamento enzimático a cada poço usando uma pipeta P1000.
- Incube a placa em uma incubadora a 37 °C por mais 5 min.
- Remova a placa e examine os poços tratados. Bata suavemente na placa para quebrar as células agregadas. Se os aglomerados de células grandes ainda estiverem visíveis, incube a placa por mais 2 minutos a 37 °C. Repita esta etapa até que os aglomerados não sejam mais visíveis a olho nu.
- Uma vez que as células estejam devidamente dissociadas, adicione 1 mL de SCMM a cada poço para desativar as enzimas de dissociação. Agrupe os 4 mL de suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e pegue uma pequena alíquota para contagem de células.
- Retorne todos os alvéolos restantes não tratados na placa de manutenção para a incubadora a 37 °C.
- Durante a contagem, centrifugue a suspensão da célula a 300 x g por 5 min.
- Determine o número total de células e calcule a quantidade de solução SCMM + Y-27632 que será necessária para atingir uma suspensão de 60.000 células/mL.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante a vácuo e adicione o volume calculado de solução SCMM + Y-27632. Misture 5-10 vezes com uma pipeta de 5 mL, garantindo uma suspensão celular uniforme.
- Transfira imediatamente a suspensão da célula para um reservatório de reagente e pipete 150 μL em cada poço da placa de 96 poços com fundo em U ULA usando uma pipeta P200 multicanal. Isso produz 96 organoides individuais, cada um consistindo inicialmente de 9.000 células.
- Centrifugue a placa a 150 x g por 1 min.
- Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C e não mexa na placa por 48 h.
2. Manutenção de Organoides Cerebrais (Dia 2)
- Prepare 17 mL de SCMM com 17 μL de 50 mM Y-27643 em um tubo cônico de 50 mL. Aquecer a solução SCMM + Y-27632 a 37 °C em banho-maria.
- Retire a placa organoide da incubadora e, usando uma pipeta P200 multicanal ajustada para 75 μL, retire lentamente o meio da borda do poço na primeira linha. Uma vez que o meio tenha sido retirado, expulse rapidamente o meio de volta para o poço para levantar células soltas e organoides. Repita isso para cada linha.
nota: Essa técnica, doravante chamada de "dispersão", levanta os detritos celulares e o organoide em suspensão. O organoide afunda rapidamente no fundo do poço, enquanto os detritos menores permanecem em suspensão, permitindo que sejam removidos com uma troca de mídia. Isso ajuda a evitar que o organoide descanse em detritos celulares durante a cultura.
- Depois que todos os poços forem dispersos, espere 15 s para garantir que os organoides tenham afundado no fundo de cada poço.
- Aspire lenta e cuidadosamente 75 μL de meio de cada poço usando a pipeta P200 multicanal e dispense em um reservatório de resíduos.
nota: A maioria dos usuários ocasionalmente aspira um organoide durante as mamadas regulares. Isso pode ocorrer cerca de 1% das vezes. Planeje adequadamente para garantir que organoides suficientes sobrevivam aos pontos de tempo experimentais.
- Transfira a solução SCMM + Y-27632 para um reservatório de reagente e dispense 150 μL em cada poço organoide usando a pipeta P200 multicanal.
- Colocar a placa de volta numa incubadora a 37 °C.
3. Manutenção de Organoides Cerebrais (Dia 3)
- Aqueça 17 mL de SCMM a 37 °C, desta vez sem Y-27643.
- Com a pipeta P200 multicanal ajustada para 100 μL, disperse todos os poços da placa organoide (consulte a etapa 2.2). Espere 15 s para garantir que os organoides tenham afundado no fundo de seus poços.
- Prepare um reservatório de resíduos e transfira o SCMM aquecido para um reservatório de origem.
- Aspire cuidadosamente 125 μL de meio de cada poço e substitua por 150 μL de SCMM fresco usando a pipeta P200 multicanal.
- Colocar a placa de volta numa incubadora a 37 °C.
4. Manutenção de Organoides Cerebrais (Dia 4+)
Nota: Realize esta manutenção regular em dias alternados até a infecção.
- Antes de iniciar a alimentação no dia 4, prepare o meio de indução neural (NI).
- Descongele uma alíquota de 250 μL de heparina 2 mg / mL, juntamente com um frasco de 5 mL de suplemento 100X N-2. Adicione os 250 μL de heparina, 5 mL de 100X N-2 e 5 mL de 100X Mínimo de Aminoácidos Essenciais Médios-Não Essenciais (MEM-NEAA) a 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) + GlutaMAX. Filtrar estéril a solução misturada em um filtro de 500 mL.
Nota: Manter o NI a 4 °C quando não estiver a ser utilizado; O NI dura até duas semanas antes que o meio fresco seja preparado.
- Aqueça 17 mL de meio NI a 37 °C.
- Com a pipeta P200 multicanal ajustada para 100 μL, disperse todos os poços da placa organoide (consulte a etapa 2.2). Espere 15 s para garantir que os organoides tenham afundado no fundo de seus poços.
- Preparar um reservatório de resíduos e transferir o NI aquecido para um reservatório de origem.
- Aspire cuidadosamente 125 μL de meio de cada poço e substitua por 125 μL de NI fresco usando a pipeta P200 multicanal.
- Colocar a placa de volta numa incubadora a 37 °C.
5. Infecção organoide pelo vírus zika (ZIKV) (~Dia 24)
NOTA: Após aproximadamente 3 semanas de diferenciação, haverá grandes estruturas neuroepiteliais e rosetas visíveis dentro do organoide que serão altamente suscetíveis à infecção pelo ZIKV.
- Leve a solução salina balanceada 1X de Earle (EBSS), a solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) e o NI a 37 ° C em banho-maria.
- Diluir o ZIKV de concentração conhecida em 1X EBSS para a multiplicidade de infecção alvo (MOI).
nota: Titulações de diferentes MOIs são recomendadas para obter uma resposta à dose viral. Isso pode variar de acordo com a cepa do vírus; para ATCC VR-1838 e ATCC VR-1843, os valores típicos de MOI variam entre 0,1 e 10).
- Remova cuidadosamente todo o meio do poço organoide usando uma pipeta P200 de canal único. Adicione rapidamente 200 μL de PBS 1X a cada poço usando uma pipeta multicanal P200 para lavar os organoides.
- Remova cuidadosamente todo o meio do poço organoide usando uma pipeta P200 de canal único. Adicione rapidamente 50 μL de solução 1X somente EBSS (infecção simulada) ou vírus ZIKV ao poço e certifique-se de que o organoide esteja completamente submerso. Repita para cada organoide a ser infectado para o estudo.
- Coloque a placa de volta em uma incubadora a 37 ° C por 2 h.
nota: A incubação de organoides infectados simulados por esse período não deve afetar significativamente seu crescimento em comparação com organoides não perturbados.
- Aproximadamente 30 minutos antes da conclusão da incubação viral, alíquota de 25 mL de NI em um tubo cônico de 50 mL e leve a 37 ° C em banho-maria.
- Após a conclusão da exposição viral, lave os organoides com 200 μL de PBS 1X para cada poço, deixe os organoides assentarem por 15 s e, em seguida, remova o PBS 1X usando uma pipeta P200 de canal único.
- Adicione 200 μL de NI fresco a cada poço e coloque de volta na incubadora.
- Opcional: Para um ponto de tempo do dia 0, os organoides podem ser fotografados uma hora após a infecção.
- Continue a cultura substituindo 125 μL de NI em dias alternados usando o método de dispersão (consulte a etapa 4). Certifique-se de descartar adequadamente a mídia e as pontas usadas, pois elas contêm partículas infecciosas do ZIKV.