1. Coloração dupla FDA-PI e cultura de neurônios granulares cerebelares (CGN)
- Prepare a solução de trabalho de diacetato-iodeto de propídio de fluoresceína (FDA-PI) adicionando 20 μL de solução estoque FDA (concentração final: 10 μg / mL) e 50 μL de solução estoque PI (concentração final: 50 μg / mL) em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture por vórtice e coloque no gelo.
nota: Prepare recentemente a solução de trabalho da solução de trabalho FDA-PI antes de usar.
- Retire a placa de cultura de células da incubadora. Coloque no gelo.
- Aspirar o meio de cultura e substituí-lo por PBS.
frio
nota: A mudança de solução deve ser feita lenta e cuidadosamente. Evite tocar nas células com pontas de pipeta.
- Aspire o PBS frio e substitua-o por FDA-PI frio (500 μL / poço para placas de cultura de células de 12 poços ou 1 mL / poço para placas de cultura de células de 6 poços). Deixe no gelo por 5 min.
- Aspire o FDA-PI e adicione PBS frio (100 μL/poço para placas de cultura de células de 12 poços ou 50 μL/poço para placas de cultura de células de 6 poços).
nota: As células não devem secar ao tirar imagens.
- Tire imagens usando microscopia fluorescente. Use um filtro de excitação com uma banda de passagem de 450 - 490 nm. Detecte as emissões de fluorescência para FDA e PI em 520 e 620 nm, respectivamente. Nas mesmas condições, tire uma imagem sob luz normal usando o modo de contraste de fase da microscopia fluorescente.
nota: Tire imagens dentro de 15 minutos após o FDA-PI. O tempo de exposição é de 100-300 ms e o ganho analógico é de 2,8x.
2. Avaliação da Viabilidade Neuronal
- Para coloração dupla FDA-PI, sobreponha as imagens das células detectadas após a filtragem por diferentes filtros de fluorescência arrastando a camada positiva para FDA na camada positiva para PI no software editor gráfico.
- Ajuste a opacidade da camada positiva para FDA inserindo "50%" no campo "Opacidade" do painel "Camadas". Mescle duas camadas clicando no botão "Mesclar visível" no menu "Camada". Defina o contraste das imagens de sobreposição digitando "50" no campo "Contraste" em "Imagem"| "Ajustes" | "Brilho/Contraste." Certifique-se de que não haja células duplamente positivas FDA e PI nas imagens de sobreposição.
