1. Procedimento de Fixação e Coloração Imunofluorescente
- Usando uma pipeta p200, transfira os cérebros dissecados do prato de 9 poços para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL cheio de 0,5 mL de paraformaldeído a 4% diluído em PTN (tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, surfactante não iônico a 0,1%). Pelo menos 10 a 15 cérebros do mesmo genótipo podem ser combinados em um tubo de microcentrífuga. Todas as etapas restantes (até a montagem dos cérebros nas lâminas) são concluídas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml.
cuidado: O paraformaldeído (PFA) deve ser manuseado em uma capela de exaustão. Os resíduos de PFA devem ser guardados e descartados adequadamente. Vinte por cento do paraformaldeído comprado em ampolas de vidro pode ser aliquotado em tubos de microcentrífuga e armazenado a -20 °C até que seja necessário.
- Dentro de uma capela de exaustão, incube os cérebros em paraformaldeído a 4% por 20 minutos com balanço em baixa velocidade à temperatura ambiente.
- Após a fixação, permita que os cérebros se acomodem no fundo do tubo da microcentrífuga por gravidade.
nota: Os cérebros podem ocasionalmente grudar na lateral do tubo da microcentrífuga. Se isso ocorrer, geralmente é útil girar lateralmente o tubo entre o dedo indicador e o polegar ou bater suavemente no tubo na bancada para promover o afundamento do cérebro.
- Remova o fixador usando uma pipeta p1000 e faça duas lavagens "rápidas" com 500 μL de PTN, permitindo que os cérebros se acomodem no fundo do tubo de microcentrífuga entre as lavagens. Durante essas lavagens rápidas, uma vez que todos os cérebros tenham se acomodado por gravidade no fundo do tubo da microcentrífuga, o PTN pode ser imediatamente trocado por tampão novo; Não é necessário tempo adicional de lavagem.
nota: Normalmente, deixar um tampão extra no tubo é preferível a arriscar a remoção do cérebro. O exame cuidadoso da ponta da pipeta é frequentemente necessário para garantir que nenhum cérebro tenha sido removido por engano do tubo. Se os cérebros foram acidentalmente pipetados na ponta, distribua-os de volta no tubo da microcentrífuga, espere que os cérebros se assentem e continue removendo qualquer PTN restante.
- Após a última lavagem rápida, use uma pipeta p1000 para realizar três lavagens "longas": adicione 500 μL de PTN e lave por 20 min em temperatura ambiente em um balancim/nutador. Todas as futuras lavagens "longas" devem ser de 20 minutos.
nota: Os cérebros fixos podem ser armazenados durante a noite a 4 °C em PTN após essas lavagens.
- Remova a última lavagem usando uma pipeta p1000 e incube os cérebros em um balancim ou nutador em temperatura ambiente em 0,5 mL de solução de bloqueio [PTN + 5% de soro de cabra normal (NGS)] por pelo menos 30 min em temperatura ambiente.
- Anticorpos secundários caprinos serão utilizados nas etapas subsequentes do protocolo. Se forem utilizados anticorpos secundários de outra espécie, deve ser utilizado soro normal dessa espécie (em vez de NGS) nas soluções de bloqueio e de anticorpos.
- Usando uma pipeta p1000, remova a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário diluído em PTN (PTN + 5% NGS + anticorpo primário diluído). Ao usar um anticorpo primário pela primeira vez, a diluição ideal desse anticorpo deve ser determinada empiricamente.
nota: Para visualizar os neurônios do corpo do cogumelo, os anticorpos que reconhecem Fas2 são normalmente usados. Esses anticorpos estão disponíveis no Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) como anticorpo 1D4 e devem ser diluídos 1:20 em PTN + 5% NGS.
- Incubar os cérebros em solução primária de anticorpos num balancim/nutador durante 2 a 3 noites a 4 °C.
- Após a incubação com anticorpos primários, permita que os cérebros se acomodem no fundo do tubo de microcentrífuga e, em seguida, remova a solução de anticorpos primários.
- Usando uma pipeta p1000, execute 2 lavagens "rápidas" e 3 lavagens "longas" de 20 minutos com 0,5 mL de PTN, conforme descrito acima nas etapas 1.4 e 1.5, permitindo cuidadosamente que os cérebros se assentem por gravidade no fundo do tubo da microcentrífuga entre cada lavagem.
- Incube cérebros por 3 h em temperatura ambiente com anticorpos secundários marcados com fluorescência apropriados. Os anticorpos secundários são geralmente diluídos em 0,5 mL de PTN + 5% NGS na concentração de 1:200.
nota: Uma vez que os anticorpos secundários fluorescentes tenham sido adicionados, os cérebros devem ser mantidos no escuro pelo restante do experimento.
- Após a incubação de anticorpos secundários, permita que os cérebros se acomodem no fundo do tubo de microcentrífuga e remova a solução de anticorpos secundários.
- Realize 2 lavagens "rápidas" e 3 lavagens "longas" de 20 minutos com 0,5 mL de PTN, conforme descrito acima nas etapas 1.4 e 1.5, permitindo cuidadosamente que os cérebros se acomodem no fundo do tubo da microcentrífuga entre cada lavagem.
- Após a terceira lavagem "longa" de 20 minutos, use uma pipeta p200 para remover o máximo de tampão possível.
- Adicione 75 μL de meio de montagem fluorescente anti-desbotamento aos cérebros. Pipete os cérebros e o meio de montagem na ponta da pipeta uma vez para misturar. Não inverta o tubo, pois os cérebros podem ficar presos na tampa ou nas laterais do tubo da microcentrífuga.
nota: Após a suspensão dos cérebros no meio de montagem, os tubos podem ser embrulhados em papel alumínio para retardar a têmpera do fluoróforo e armazenados a 4 ° C durante a noite. Se necessário, os cérebros podem ser armazenados por vários dias a 4 ° C, mas o ideal é que sejam montados em lâminas o mais rápido possível.
2. Montagem de cérebros adultos de D. melanogaster em lâminas de microscópio e imagens
- Construa um escorregador de "ponte". Posicione duas lamínulas de "base" a cerca de 1 cm de distância em uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente do slide esteja voltado para cima. Cole as lamínulas na lâmina com esmalte de unha, conforme mostrado na Figura 1A. Selar as três bordas externas de cada lamínula de base com esmalte de unha geralmente é útil para garantir que a mídia de montagem não absorva sob essas lamínulas de base. Deixe o esmalte secar completamente (10 - 15 min) antes de prosseguir.
- Colocar a lâmina sob o estereomicroscópio e pipetar a solução do meio de montagem contendo os cérebros dissecados no espaço entre as duas lamínulas. Para fornecer mais contraste, é útil manobrar as luzes gooseneck para que fiquem paralelas ao tampo da bancada.
- Remova a mídia de montagem extra da lâmina usando uma pipeta, tomando cuidado para não pipetar os miolos da lâmina.
- Absorva a mídia de montagem extra. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão durante a próxima etapa.
- Usando um par de pinças e o estereomicroscópio, posicione os cérebros na lâmina em um padrão de grade com os lobos antenais voltados para cima.
- Coloque uma lamínula (a "ponte") sobre os cérebros (Figura 1A). Use esmalte para selar as laterais da lamínula da ponte onde elas entram em contato com as lamínulas da "base".
- Usando uma pipeta p200, encha lentamente a cavidade central sob a ponte com um novo meio de montagem (Figura 1B). Coloque uma gota de cada vez na borda aberta da lamínula central e deixe a mídia de montagem passar por baixo da lamínula da ponte central. Continue até que toda a cavidade esteja preenchida com a mídia de montagem e, em seguida, sele a parte superior e inferior com esmalte transparente.
- Quando o esmalte estiver seco, fotografe as lâminas imediatamente ou guarde-as em uma caixa de lâminas à prova de luz a -20 °C.
- Dentro de uma semana, os cérebros de imagem usam um microscópio confocal de varredura a laser com lasers de excitação e cubos de filtro apropriados para os anticorpos secundários fluorescentes escolhidos. Imagens Z-stack de neurônios do corpo de cogumelo são normalmente obtidas usando objetivas de 20X ou 40X.
