1. Preparação para microinjeção
- Prepare-se para a injeção puxando os capilares de vidro usando um extrator de micropipeta (consulte a Tabela de Materiais), seguindo o protocolo de cinco etapas para tração do tubo capilar de vidro (Tabela 1).
- Abra a ponta da agulha (capilares de vidro de parede fina [3,5 pol] com filamento, diâmetro externo [OD] 1,14 mm) no tamanho apropriado em um ângulo usando uma pinça (Figura 1A).
- Encha a agulha com 0,1 mL de óleo mineral para garantir que não haja bolhas.
- Remova a tampa de rosca da agulha de aço do aparelho de microinjeção. Alinhe o orifício da agulha de vidro com a agulha de aço e aperte a tampa de rosca. Monte o aparelho de microinjeção de agulha carregada em um micromanipulador (consulte a Tabela de Materiais).
- Ajuste a posição do aparelho de microinjeção para que o micromanipulador possa mover o aparelho de forma flexível sob o microscópio. Descarregue um certo volume de óleo de parafina para fazer a agulha de aço entrar no tubo de vidro capilar.
- Coloque a solução injetável (como solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 1× ou LPS 5 mg/mL) em uma lâmina de vidro esterilizada com etanol a 70% e ajuste o aparelho de microinjeção para que a ponta seja inserida na gota líquida. Carregue ~ 2 μL de solução injetável na agulha.
- Configure o micromanipulador (configurações de ajuste fino para cima, para baixo, para a esquerda e para a direita) de modo que a ponta da agulha do aparelho de microinjeção fique no mesmo campo de visão que as larvas em alta ampliação (Figura 1B).
2. Montagem de peixe-zebra para microinjeções
NOTA: O desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra ocorre dentro de 3 dias após a fertilização (dpf) e amadurece a 5 dpf com um sistema nervoso central bem desenvolvido. Portanto, as larvas de 5 dpf já são adequadas para estudar danos neuronais mediados por LPS, bem como respostas comportamentais e inflamatórias.
- Injete as larvas de peixe-zebra dentro de aproximadamente 30 minutos após atingir o estágio de interesse, para manter a consistência do tempo de injeção.
- Para anestesiar as larvas do peixe-zebra, combine tricaína com água limpa do tanque de peixes (concentração final de 0,02% p / v de tricaína).
- Derreta uma solução de agarose a 2% em água bidestilada (ddH2O) usando um micro-ondas. Despeje a agarose derretida em um prato de plástico. O prato de plástico revestido com agarose a 2% pode ser armazenado a 4 °C por até 2 semanas.
- Use uma pipeta de transferência de plástico para transportar as larvas anestesiadas para o centro do prato de plástico revestido com agarose a 2%. Oriente as larvas montadas com o cérebro voltado para cima para acesso à agulha.
3. Injetando o ventrículo cerebral
- Ajuste a ampliação do microscópio para que a estrutura ventricular do cérebro do peixe-zebra seja claramente exibida no campo de visão (Figura 1B).
- Coloque a agulha cuidadosamente acima do tectum cerebral (Figura 1C).
- Perfure a pele do cérebro do peixe-zebra com a ponta da agulha lentamente usando o micromanipulador.
- Pressione o pedal para ejetar 1 nL de 1x PBS ou diferentes concentrações de LPS (1.0, 2.5 e 5.0 mg/mL) (consulte a Tabela de Materiais). Imagens de injeção de ventrículo bem-sucedidas nas quais o ventrículo cerebral foi injetado com 1 nL de corante azul de Evans a 1% (diluído em PBS) são mostradas como exemplo (Figura 1D). Transfira as larvas para o meio de água limpa do ovo (E3) imediatamente após a injeção. Após 24 h, coletar as larvas para imagens microscópicas, ensaio comportamental da locomotiva e determinação de outros indicadores.
