1. Preparação Experimental
NOTA: As seguintes soluções de estoque podem ser preparadas e mantidas até o uso.
- Solução de dissecção
- Dissolva 3,62 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 0,069 g de fosfato de sódio (NaH2PO4 ∙ H2O) e 1,306 g de D-(+)-glicose em 500 mL de H2O destilado. Em seguida, adicione 12,5 mL de tampão HEPES, 450 μL de solução de vermelho de fenol e 20 mL de albumina de soro bovino (BSA) fração V à solução. Ajuste para pH 7,4 usando hidróxido de sódio (NaOH) 1 N.
- Esterilizar com um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C. Esta solução permanecerá estável por até uma semana a 10 dias.
- tripsina
- Prepare uma solução de estoque na concentração de 25 g / L de tripsina em cloreto de sódio a 0,9%. Conservar a solução a -20 °C.
- Inibidor de tripsina
- Preparar um caldo com uma concentração de 10 mg/ml, dissolvendo 1 g de inibidor de tripsina da clara de ovo de galinha em 100 ml de HCl 1 mM. Conservar esta solução a -20 °C.
- Desoxirribonuclease (DNase)
- Dissolva 100 mg de DNase 1 em 10 mL de água estéril para gerar um estoque de 10 mg / mL. Conservar a solução a -20 °C.
- MgSO4
- Adicione 6,02 g de sulfato de magnésio (MgSO4) a 50 mL de água destilada (H2O) para gerar um estoque de 1 M. Conservar a solução a 4 °C.
- CaCl2
- Dissolver 0,735 g de cloreto de cálcio (CaCl2∙ 2H2O) em 50 ml de H2O destilado até uma concentração de reserva de 100 mM. Conservar a solução a 4 °C.
- Kcl
- Dissolver 3,7275 g de KCl em 50 ml de H2O destilado até uma concentração de reserva de 1 M. Conservar a solução a 4 °C.
- D-(+)-Glicose
- Dissolver 1,802 g de D-(+)-glicose em 50 ml de H2O destilado até uma concentração de reserva de 100 mM. Conservar a solução a 4 °C.
- Meios de cultura celular
- Prepare os meios de cultura celular da seguinte forma: 5 mL de soro fetal bovino dialisado inativado por calor, 500 μL de 200 mM de L-glutamina, 100 μL de 50 mg / mL de gentamicina e 1 mL de 1,0 M KCL devem ser adicionados a 45 mL de meio essencial mínimo de Eagle esterilizado por filtro (E-MEM) que é suplementado com 1.125 g / L de D-glicose para gerar 50 mL de meio de cultura de neurônio granular cerebelar (CGN). Armazene mídia a 4 °C.
- Citosina Beta-D-Arabino Furanoside
- Dissolver 48 mg de citosina beta-D-arabino furanosídeo em 10 ml de meios de crescimento até uma concentração de reserva de 20 mM. Armazene a solução a -20 °C.
- Poli-D-Lisina
- Para gerar um estoque de poli D-lisina de 2 mg / mL, adicione 10 mL de H2O estéril a 20 mg de poli D-lisina. A poli D-lisina de estoque deve ser armazenada a -80 °C em alíquotas de 100 μL.
nota: As soluções que se seguem devem ser preparadas antes da dissecação e mantidas a 4 °C até à utilização.
- Solução de Dissecção Suplementada com MgSO4
- Adicione 300 μL de estoque de MgSO4 a 250 mL de solução de dissecção.
- Solução de dissecção de tripsina
- Adicione 100 μL de tripsina estoque e 12 μL de MgSOestoque 4 a 10 mL de solução de dissecação.
- Solução Inibidora de Tripsina 1
- Adicione 164 μL de inibidor de tripsina estoque, 250 μL de estoque DNase 1 e 12 μL de estoque MgSO4 a 10 mL de solução de dissecção.
- Solução Inibidora de Tripsina 2
- Adicione 1040 μL de inibidor de tripsina estoque, 750 μL de estoque DNase 1 e 12 μL de estoque MgSO4 a 10 mL de solução de dissecação.
- Solução de dissecção suplementada com CaCl2
- Adicione 10 μL de estoque de CaCl2 e 25 μL de estoque de MgSO4 a 10 mL de solução de dissecção.
- Placas de cultura revestidas com poli D-lisina
- Para revestir placas de cultura, dilua 100 μL de poli D-lisina em 40 mL de H2O estéril. Para placas de cultura Nunc de 35 mm, adicione 2 mL de solução diluída de poli D-lisina. Para placas de 4 poços, adicione 300 μL de poli D-lisina diluída a cada poço.
- Deixe a poli D-lisina descansar por 1 h antes de aspirar e lavar cada poço com 4 mL ou 600 μL (para placas de cultura de 35 mm ou placas de 4 poços, respectivamente) de H2O estéril. Em seguida, aspire o H2O e deixe a loiça secar ao ar durante 1 h.
2. Extração de cérebro e isolamento do cerebelo
- Decapite um filhote de rato de 6 a 7 dias usando uma tesoura de decapitação. Realize a dissecção do cérebro em uma capa de cultura de tecidos estéril.
- Para remover o cérebro, segure a cabeça usando uma pinça e corte a pele em direção à parte anterior da cabeça usando uma tesoura de microdissecação, conforme demonstrado na Figura 1. Em seguida, corte o osso do crânio usando uma nova tesoura para minimizar o risco de contaminação. Remova o crânio que cobre o cérebro usando uma pinça e provoque o cérebro usando uma pinça ou uma espátula.
- Conforme necessário, corte o nervo óptico para facilitar a retirada do cérebro como um todo.
- Coloque o cérebro na solução de dissecação, que é suplementada com MgSO4. Mantenha a solução e o cérebro no gelo.
- Após a remoção do cérebro, sob um microscópio de dissecação, dissecar o cerebelo do cérebro ainda em solução de dissecção suplementada com MgSO4 e remover as meninges usando uma pinça fina. Vire o cerebelo para o lado ventral e assegure a remoção do plexo coróide.
- Agrupe o cerebelo em um prato de 35 mm contendo ~ 1 mL de solução de dissecção suplementada com MgSO4.
- Pique o tecido em pedaços pequenos e transfira para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de dissecção tamponada com MgSO4.
3. Isolamento e cultura de neurônios de grânulos cerebelares de camundongos
- Centrifugue o tubo de 50 ml contendo o tecido cerebral picado durante 5 min a 644 x g e 4 °C.
- Remova o sobrenadante e adicione 10 mL de solução de dissecção de tripsina. Em seguida, agite o tubo em alta velocidade por 15 min a 37 °C.
- Adicione 10 mL de solução inibidora de tripsina 1 ao tubo e balance suavemente por 2 min.
- Centrifugue o tubo por 5 min a 644 x g e 4 °C.
- Remova o sobrenadante e adicione 2 mL de solução inibidora de tripsina 2 e, em seguida, transfira para um tubo de 15 mL.
- Triturar o tecido no tubo de 15 mL até que a solução fique turva. Em seguida, deixe repousar por 5 min.
- Remova o sobrenadante transparente e transfira o sobrenadante para um novo tubo contendo 1 mL de solução de dissecção suplementada com CaCl2.
- Adicione outro ml de solução inibidora de tripsina 2 ao fundo do tubo que contém o pellet do passo 3.6. Triturar novamente e deixar repousar durante 5 min. Remova o sobrenadante e adicione-o ao tubo que contém o sobrenadante da etapa 3.7 (ou seja, uma repetição das etapas 3.6-3.7). Repita esse processo até que a maior parte do tecido esteja mecanicamente dissociada.
- Adicione 0,3 mL de solução de dissecção suplementada com CaCl2 à coleção de sobrenadantes para cada mL de sobrenadante.
- Misture o conteúdo do tubo e centrifugue por 5 min a 644 x g.
- Retire o sobrenadante e adicione 10 ml de meio fresco ao pellet e misture.
- As células podem então ser contadas e diluídas a uma concentração de 1,5 x 106 células/mL. Observe que, em geral, 10 milhões de células são esperadas de cada cérebro dissecado, dependendo do tempo de tripsinização e da eficiência da dissecação. Células de placa em placas de poli D-lisina feitas anteriormente. Para placas de 4 poços, placa de 0,5 mL, dando 7,5 x 105 células por poço. Para pratos de 35 mm, placa 4 mL, dando 6 x 106 células por placa.
- Após 24 h, adicione citosina-β-arabino furanosídeo (AraC) às placas para reduzir a contaminação glial. Para cada mL de meio é necessário 0,5 μL de 20 mM AraC. A adição do AraC não requer uma alteração de mídia. Se as células forem mantidas por 7-8 dias, repita este tratamento no dia 3.
- Mantenha as culturas em uma incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C e alimente com 100 μL de glicose 100 mM adicionada à cultura para cada 2 mL de meio a cada 2 mL de meio a cada 2 dias após 5 dias. Uma mudança completa de mídia não é necessária.
4. Modelagem de Lesão Neuronal
- Para induzir a morte celular induzida por ROS (estresse oxidativo), trate os neurônios com 75-100 μM de peróxido de hidrogênio (H2O2) e mude para meios condicionados de culturas paralelas após 5 minutos de exposição a H2O2. Observe que, devido à instabilidade de H2O2, otimize a concentração a um nível que induza 50-70% de morte celular em cultura após 24 h de tratamento (Figura 2).
