Modelagem da morte neuronal induzida por espécies reativas de oxigênio em neurônios de grânulos cerebelares de camundongos

1. Preparação Experimental

NOTA: As seguintes soluções de estoque podem ser preparadas e mantidas até o uso.

1. Solução de dissecção
   1. Dissolva 3,62 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 0,069 g de fosfato de sódio (NaH₂PO₄ ∙ H₂O) e 1,306 g de D-(+)-glicose em 500 mL de H₂O destilado. Em seguida, adicione 12,5 mL de tampão HEPES, 450 μL de solução de vermelho de fenol e 20 mL de albumina de soro bovino (BSA) fração V à solução. Ajuste para pH 7,4 usando hidróxido de sódio (NaOH) 1 N.
   2. Esterilizar com um filtro de 0,22 μm e conservar a 4 °C. Esta solução permanecerá estável por até uma semana a 10 dias.
2. tripsina
   1. Prepare uma solução de estoque na concentração de 25 g / L de tripsina em cloreto de sódio a 0,9%. Conservar a solução a -20 °C.
3. Inibidor de tripsina
   1. Preparar um caldo com uma concentração de 10 mg/ml, dissolvendo 1 g de inibidor de tripsina da clara de ovo de galinha em 100 ml de HCl 1 mM. Conservar esta solução a -20 °C.
4. Desoxirribonuclease (DNase)
   1. Dissolva 100 mg de DNase 1 em 10 mL de água estéril para gerar um estoque de 10 mg / mL. Conservar a solução a -20 °C.
5. MgSO₄
   1. Adicione 6,02 g de sulfato de magnésio (MgSO₄) a 50 mL de água destilada (H₂O) para gerar um estoque de 1 M. Conservar a solução a 4 °C.
6. CaCl₂
   1. Dissolver 0,735 g de cloreto de cálcio (CaCl₂∙ 2H₂O) em 50 ml de H₂O destilado até uma concentração de reserva de 100 mM. Conservar a solução a 4 °C.
7. Kcl
   1. Dissolver 3,7275 g de KCl em 50 ml de H₂O destilado até uma concentração de reserva de 1 M. Conservar a solução a 4 °C.
8. D-(+)-Glicose
   1. Dissolver 1,802 g de D-(+)-glicose em 50 ml de H₂O destilado até uma concentração de reserva de 100 mM. Conservar a solução a 4 °C.
9. Meios de cultura celular
   1. Prepare os meios de cultura celular da seguinte forma: 5 mL de soro fetal bovino dialisado inativado por calor, 500 μL de 200 mM de L-glutamina, 100 μL de 50 mg / mL de gentamicina e 1 mL de 1,0 M KCL devem ser adicionados a 45 mL de meio essencial mínimo de Eagle esterilizado por filtro (E-MEM) que é suplementado com 1.125 g / L de D-glicose para gerar 50 mL de meio de cultura de neurônio granular cerebelar (CGN). Armazene mídia a 4 °C.
10. Citosina Beta-D-Arabino Furanoside
    1. Dissolver 48 mg de citosina beta-D-arabino furanosídeo em 10 ml de meios de crescimento até uma concentração de reserva de 20 mM. Armazene a solução a -20 °C.
11. Poli-D-Lisina
    1. Para gerar um estoque de poli D-lisina de 2 mg / mL, adicione 10 mL de H₂O estéril a 20 mg de poli D-lisina. A poli D-lisina de estoque deve ser armazenada a -80 °C em alíquotas de 100 μL.
       nota: As soluções que se seguem devem ser preparadas antes da dissecação e mantidas a 4 °C até à utilização.
12. Solução de Dissecção Suplementada com MgSO₄
    1. Adicione 300 μL de estoque de MgSO₄ a 250 mL de solução de dissecção.
13. Solução de dissecção de tripsina
    1. Adicione 100 μL de tripsina estoque e 12 μL de MgSO_{estoque 4} a 10 mL de solução de dissecação.
14. Solução Inibidora de Tripsina 1
    1. Adicione 164 μL de inibidor de tripsina estoque, 250 μL de estoque DNase 1 e 12 μL de estoque MgSO₄ a 10 mL de solução de dissecção.
15. Solução Inibidora de Tripsina 2
    1. Adicione 1040 μL de inibidor de tripsina estoque, 750 μL de estoque DNase 1 e 12 μL de estoque MgSO₄ a 10 mL de solução de dissecação.
16. Solução de dissecção suplementada com CaCl₂
    1. Adicione 10 μL de estoque de CaCl₂ e 25 μL de estoque de MgSO₄ a 10 mL de solução de dissecção.
17. Placas de cultura revestidas com poli D-lisina
    1. Para revestir placas de cultura, dilua 100 μL de poli D-lisina em 40 mL de H₂O estéril. Para placas de cultura Nunc de 35 mm, adicione 2 mL de solução diluída de poli D-lisina. Para placas de 4 poços, adicione 300 μL de poli D-lisina diluída a cada poço.
    2. Deixe a poli D-lisina descansar por 1 h antes de aspirar e lavar cada poço com 4 mL ou 600 μL (para placas de cultura de 35 mm ou placas de 4 poços, respectivamente) de H₂O estéril. Em seguida, aspire o H₂O e deixe a loiça secar ao ar durante 1 h.

2. Extração de cérebro e isolamento do cerebelo

1. Decapite um filhote de rato de 6 a 7 dias usando uma tesoura de decapitação. Realize a dissecção do cérebro em uma capa de cultura de tecidos estéril.
2. Para remover o cérebro, segure a cabeça usando uma pinça e corte a pele em direção à parte anterior da cabeça usando uma tesoura de microdissecação, conforme demonstrado na Figura 1. Em seguida, corte o osso do crânio usando uma nova tesoura para minimizar o risco de contaminação. Remova o crânio que cobre o cérebro usando uma pinça e provoque o cérebro usando uma pinça ou uma espátula.
   1. Conforme necessário, corte o nervo óptico para facilitar a retirada do cérebro como um todo.
3. Coloque o cérebro na solução de dissecação, que é suplementada com MgSO₄. Mantenha a solução e o cérebro no gelo.
4. Após a remoção do cérebro, sob um microscópio de dissecação, dissecar o cerebelo do cérebro ainda em solução de dissecção suplementada com MgSO₄ e remover as meninges usando uma pinça fina. Vire o cerebelo para o lado ventral e assegure a remoção do plexo coróide.
5. Agrupe o cerebelo em um prato de 35 mm contendo ~ 1 mL de solução de dissecção suplementada com MgSO₄.
6. Pique o tecido em pedaços pequenos e transfira para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de solução de dissecção tamponada com MgSO₄.

3. Isolamento e cultura de neurônios de grânulos cerebelares de camundongos

1. Centrifugue o tubo de 50 ml contendo o tecido cerebral picado durante 5 min a 644 x g e 4 °C.
2. Remova o sobrenadante e adicione 10 mL de solução de dissecção de tripsina. Em seguida, agite o tubo em alta velocidade por 15 min a 37 °C.
3. Adicione 10 mL de solução inibidora de tripsina 1 ao tubo e balance suavemente por 2 min.
4. Centrifugue o tubo por 5 min a 644 x g e 4 °C.
5. Remova o sobrenadante e adicione 2 mL de solução inibidora de tripsina 2 e, em seguida, transfira para um tubo de 15 mL.
6. Triturar o tecido no tubo de 15 mL até que a solução fique turva. Em seguida, deixe repousar por 5 min.
7. Remova o sobrenadante transparente e transfira o sobrenadante para um novo tubo contendo 1 mL de solução de dissecção suplementada com CaCl₂.
8. Adicione outro ml de solução inibidora de tripsina 2 ao fundo do tubo que contém o pellet do passo 3.6. Triturar novamente e deixar repousar durante 5 min. Remova o sobrenadante e adicione-o ao tubo que contém o sobrenadante da etapa 3.7 (ou seja, uma repetição das etapas 3.6-3.7). Repita esse processo até que a maior parte do tecido esteja mecanicamente dissociada.
9. Adicione 0,3 mL de solução de dissecção suplementada com CaCl₂ à coleção de sobrenadantes para cada mL de sobrenadante.
10. Misture o conteúdo do tubo e centrifugue por 5 min a 644 x g.
11. Retire o sobrenadante e adicione 10 ml de meio fresco ao pellet e misture.
12. As células podem então ser contadas e diluídas a uma concentração de 1,5 x 10⁶ células/mL. Observe que, em geral, 10 milhões de células são esperadas de cada cérebro dissecado, dependendo do tempo de tripsinização e da eficiência da dissecação. Células de placa em placas de poli D-lisina feitas anteriormente. Para placas de 4 poços, placa de 0,5 mL, dando 7,5 x 10⁵ células por poço. Para pratos de 35 mm, placa 4 mL, dando 6 x 10⁶ células por placa.
13. Após 24 h, adicione citosina-β-arabino furanosídeo (AraC) às placas para reduzir a contaminação glial. Para cada mL de meio é necessário 0,5 μL de 20 mM AraC. A adição do AraC não requer uma alteração de mídia. Se as células forem mantidas por 7-8 dias, repita este tratamento no dia 3.
14. Mantenha as culturas em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C e alimente com 100 μL de glicose 100 mM adicionada à cultura para cada 2 mL de meio a cada 2 mL de meio a cada 2 dias após 5 dias. Uma mudança completa de mídia não é necessária.

4. Modelagem de Lesão Neuronal

1. Para induzir a morte celular induzida por ROS (estresse oxidativo), trate os neurônios com 75-100 μM de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e mude para meios condicionados de culturas paralelas após 5 minutos de exposição a H₂O₂. Observe que, devido à instabilidade de H₂O₂, otimize a concentração a um nível que induza 50-70% de morte celular em cultura após 24 h de tratamento (Figura 2).

Figura 1: Remoção do cérebro do camundongo e dissecção do cerebelo. (A) Para extrair o cérebro de um camundongo de 6 a 7 dias de idade, usando uma pinça, segure a cabeça e corte a pele anteriormente ao longo das linhas pontilhadas usando uma tesoura de microdissecação. Tenha cuidado para cortar apenas a pele e o tecido conjuntivo, uma incisão muito profunda pode perfurar o crânio e danificar o cérebro. Essas três incisões, retas ao longo da linha média e duas curvadas lateralmente, permitem que a pele seja empurrada para trás, revelando o crânio. Uma vez exposto, o crânio pode ser penetrado com a ponta da tesoura e cortado anteriormente. Deve-se tomar muito cuidado para não danificar o cerebelo para facilitar a identificação e remoção das meninges. Uma vez cortada, uma pinça pode ser usada para descascar o crânio, expondo o cérebro, que pode então ser transformado em uma solução de dissecção fria usando um par de pinças ou espátula. Para remover o cérebro, o nervo óptico pode precisar ser cortado. (B) Uma vez removidas do crânio, as meninges devem ser removidas do cerebelo usando um par de pinças de ponta fina. (C) Usando um par de pinças de ponta fina, o cerebelo é dissecado do tecido remanescente e inspecionado para garantir a remoção completa das meninges.

Figura 2: Modelagem de lesão neuronal em neurônios granulares cerebelares. O cerebelo isolado de camundongos do dia 6-7 é dissociado em células únicas seguindo o procedimento apresentado na parte 3. Após a dissociação, as células são contadas e ressuspensas em um volume de meio de cultura para gerar 1,5 x 106 células/mL. Para placas de 35 mm, 4 mL são plaqueadas, dando 6 x 106 células por placa. Para lâminas de imagem, 0,5 mL é plaqueado, dando 7,5 x 105 células/poço. Os CGNs podem então ser transduzidos com lentivírus ou infectados com adenovírus. O uso de adenovírus no dia do plaqueamento (0 dias in vitro (DIV)) fornece mais de 90% de eficiência de transfecção e permite o estudo da lesão neuronal por meio de estresse oxidativo e danos ao DNA. A adição de 10 μM de camptotecina (CPT) induzirá danos ao DNA, enquanto 75-100 μM de peróxido de hidrogênio (H2O2) induzirá estresse oxidativo. A concentração de H2O2 deve ser otimizada para induzir 50% de morte celular após 24h. A infecção com adenovírus em 5 DIV proporciona uma eficiência de transdução mais baixa de menos de 10%. Em 7 DIV, quando os receptores NMDA são enriquecidos na cultura, os neurônios podem ser tratados com 100 μM NMDA e 10 μM de glicina para induzir a excitotoxicidade. Isso é ideal para análise de imagem subsequente ou rastreamento de um único neurônio. Finalmente, a transdução com lentivírus a 0 DIV, seguida de tratamento com 100 μM NMDA e 10 μM de glicina a 7 DIV, fornece uma eficiência de transdução suficientemente alta (>80%) para permitir a análise bioquímica da cultura, incluindo sequenciamento de ChIP, exame da expressão de proteínas e realização de ensaios vivos/mortos.