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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Imuno-histoquímica
- Coloração análoga de timidina
- Coloque seções de tecido em PBS (solução salina tamponada com fosfato) e monte seções de 5 a 8 em uma lâmina carregada positivamente, mantendo a ordem serial de anterior para posterior e a mesma orientação. Deixe as seções de tecido secarem para aderir completamente às lâminas e, em seguida, desenhe uma borda usando uma caneta hidrofóbica ou caneta PAP.
- Permeabilize as seções com tampão de permeabilização (0,5% TBS (solução salina tamponada com tris) -triton) por 20 a 30 min. Em seguida, lave as seções 2x usando TBS-triton por 5 min cada.
NOTA: A permeabilização auxilia na penetração de anticorpos intracelulares. O tempo de permeabilização pode ser ajustado dependendo da espessura do tecido e da eficiência do anticorpo. Alternativamente, pode-se aumentar a concentração do detergente para aumentar a potência de permeabilização. No entanto, deve-se tomar cuidado para não permeabilizar por muito tempo, pois a fragilidade do tecido aumenta com o tempo prolongado de permeabilização.
- Preparar a solução de reacção Edu (5-etinil-2'-desoxiuridina) de acordo com o quadro 1. A concentração final de Alexa488-azida é de 15 μM em 1 mL de solução de reação Edu.
- Incubar seções na solução de reação Edu por 30 min a 1 h e depois lavar 3x em TBS-triton por 5 min cada. Após esta etapa, cubra as lâminas com papel alumínio para protegê-las da luz. Nesta fase, verifique se a reação de Edu funciona usando um microscópio fluorescente. As células marcadas com edu irão fluorescer sob um microscópio de epifluorescência.
- Protocolo de seção de tecido montado
- Bloqueie as seções de tecido montadas em uma lâmina da etapa 1.1.4 usando tampão de bloqueio criado nos mesmos animais que o anticorpo secundário, por exemplo, soro de burro, por 30 min a 1 h e depois lave 2x em TBS-triton por 5 min cada.
- Prepare a solução de anticorpo primário (ou seja, anti-nestina de frango) durante a etapa de bloqueio, misturando anticorpos primários na solução tampão de bloqueio a 1:200. 250 μL por lâmina são suficientes para garantir que o tecido esteja completamente submerso na solução.
- Incube seções de tecido em uma solução de anticorpo primário durante a noite em RT após o bloqueio das lavagens. Modifique esta etapa dependendo do anticorpo primário usado.
nota: Se os anticorpos tiverem um alto nível de base ou ligação não específica, a incubação a 4 °C em vez de RT (temperatura ambiente) pode melhorar os resultados. Anticorpos com baixa penetração tecidual podem ser deixados para incubar por 2 dias, se necessário.
- Incube seções de tecido 3x em TBS-triton por 5 min para remover o excesso de anticorpo primário. Em seguida, incube seções de tecido em anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (por exemplo, Alexa 647 anti-frango a 1:200) preparados em solução tampão de bloqueio por 2 h em RT.
- Incube seções de tecido 3x em TBS-triton por 5 min para remover o excesso de anticorpo secundário e aplique 300 μM de solução de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) a 1:100 em PBS por 15 min em RT.
- Incube seções de tecido 3x em PBS por 5 min para remover o excesso de DAPI e remova o círculo da caneta de papanicolau ao redor do tecido usando um cotonete ou um lenço delicado. Deixe as seções secarem e, em seguida, aplique a mídia de montagem e a lamínula. Deixe a mídia de montagem secar antes de criar imagens de slides.
Tabela 1: Soluções utilizadas para imuno-histoquímica
| Solução anticongelante | Etilenoglicol 150 mL + sacarose 150 g + enchimento até 500 mL 0,1 M PB para solução de 500 mL |
| Tampão de citrato | 9 mL de estoque de ácido cítrico + 41 mL de tampão citrato trissódico + 450 mL de ddH2O |
| Caldo de ácido cítrico | [0,1 M] Ácido cítrico 21 g/1 L ddH2O |
| Estoque de citrato trissódico | [0,1 M] Citrato Trissódico 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris tamponado com solução salina -Triton (TBS-Triton) | 0,05% 100-x Triton em TBS |
| Tampão de permeabilização | 0,5% 100-x Triton em TBS |
| Buffer de bloqueio | 0,33 mL de soro de burro em 10 mL de TBS-Triton |
| Solução de reação Edu | Faça uma solução de CuSO4·5H2O adicionando 1 mg de CuSO4·5H2O em 4 mL de solução de [0,1 M] Tris pH 8,5. Em seguida, adicione 1:40 de uma solução de Alexa488-azida 600 μM e 10 mg / mL de ascorbato L-Na+ à solução de CuSO4 ·5H 2O antes de aplicá-la ao tecido. |