Determinando a toxicidade induzida por nanopartículas em neurônios usando microglia como biossensor substituto

Resumo

Fonte: Duffy, C. M. et al., Microglia como um biossensor substituto para determinar a neurotoxicidade de nanopartículas.J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um método para avaliar os efeitos neurotóxicos das nanopartículas usando microglia. Ele descreve as etapas para ativar a microglia com nanopartículas, filtrar meios condicionados para isolar citocinas pró-inflamatórias derivadas da microglia e testar a toxicidade dos neurônios hipotalâmicos com os meios condicionados.

Protocolo

1. Manutenção da Cultura de Células Microgliais

1. Meio de cultura de células quentes (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN) a 37 °C.
2. Obter estoque congelado de células microgliais BV2 na passagem 18 - 25 do armazenamento a -80 °C. Descongelar rapidamente as células em banho-maria a 37 °C.
3. Transferir cuidadosamente as células para um balão de 75 cm² com ventilação contendo 10 ml de meios de cultura celular.
4. Incubar o balão em CO₂ a 5% a 37 °C. Aspirar o meio após 24 horas e substituí-lo por meio novo. Cultive células até aproximadamente 70 - 80% de confluência.

2. Contagem e revestimento de células

1. Em banho-maria a 37 °C, aqueça DMEM e solução de ácido 1x-tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA).
2. Aspirar os meios das células e adicionar 500 μl de tripsina. Incube a 37 ° C por 2 a 5 min.
3. Com a ajuda de um raspador, retirar as células do balão e suspendê-las em 5 ml de DMEM. Passar as células através de um filtro de 70 μm para um tubo de 50 ml três vezes.
4. Conte as células usando um hemocitômetro e semeie 8.000 células/poço em uma placa de fundo transparente de parede preta em um volume final de 200 μl de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN. Incubar a placa em 5% de CO₂ a 37 °C por 24 horas.
5. Remova o DMEM antigo e substitua-o por 200 μl de DMEM aquecido suplementado com 1% de PSN para soro, carente de microglia. Incubar a placa em 5% de CO₂ a 37 °C por 24 horas.

3. Ativando a Microglia

1. Em tubos separados, diluir nanopartículas de prata (AgNPs) (0,01, 0,05 ou 0,1 μg/ml) e veículo/controle neutro (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM sem soro suplementado com 1% de PSN até as concentrações finais de trabalho.
2. Remover 100 μl de meio de cada alvéolo e substituir por 100 μl de composto de tratamento adequado.
3. Incubar a placa em CO₂ a 5 % a 37 °C durante 24 horas.

4. Filtrando mídia condicionada

1. Coletar 200 μl de sobrenadante de meio de cada alvéolo e transferi-lo para um filtro (limite de peso molecular de 10 kDa) com tubo de coleta (capacidade de 1,5 a 2 ml).
2. Centrifugue a 14.000 x g em temperatura ambiente por 15 min.
3. Descarte o fluxo (sobrenadante com partículas) e coloque o filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de coleta.
4. Centrifugue a 1.000 x g em temperatura ambiente por 2 min.
   nota: O meio filtrado resultante (contendo citocinas secretadas) é concentrado seis vezes.
5. Levar o volume do concentrado a 400 μl com DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN e conservar com gelo.

5. Manutenção da cultura de células hipotalâmicas

1. Meio de cultura de células DMEM quente suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN a 37 °C.
2. Obter um stock congelado de células hipotalâmicas (mHypo-A1/2) na passagem 18 - 25 armazenadas a 80 °C. Descongelar rapidamente as células num banho-maria a 37 °C.
3. Transferir cuidadosamente as células para um balão de 75 cm² com ventilação contendo 10 ml de meios de cultura celular.
4. Incubar o balão em CO₂ a 5% a 37 °C. Aspirar o meio após 24 horas e substituí-lo por meio novo. Cultive as células até que estejam aproximadamente em 70 - 80% de confluência.

6. Determinando a toxicidade das células hipotalâmicas

1. Aquecer a solução de DMEM e 1x-tripsina-EDTA em banho-maria a 37 °C.
2. Aspirar o meio das células hipotalâmicas e adicionar 500 μl de tripsina. Incubar a 37 °C durante 2 - 5 min. Remova as células do frasco usando um raspador, conforme descrito acima na etapa 2.
3. Conte as células usando um hemocitômetro e células hipotalâmicas em placa a 5.000 células/poço em uma placa de fundo transparente de parede preta em um volume final de 200 μl de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN, e incube durante a noite em 5% de CO₂ a 37 ° C.
4. Remova 100 μl de mídia antiga usando um pipetador multicanal e adicione 100 μl de mídia condicionada concentrada filtrada a uma concentração final de 1x.
5. Incubar a placa em 5% de CO₂ a 37 °C por 24 horas.
6. Adicione 22 μl de reagente de resazurina e incube a placa por 20 min em 5% de CO₂ a 37 ° C.
7. Usando um espectrofotômetro multimodo, registre a fluorescência (560 nm EX / 590 nm EM) para medir a viabilidade celular. Relate os resultados como unidades de fluorescência relativa (RFU).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células/Reagentes
Linhagem celular microglial de camundongo (BV2)	Coleção de linhagens celulares interlab (Gênova, Itália)	ATL03001
Linha celular de hipotálamo de camundongo adulto mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Meio de Águia Modificado de Dulbecco	Invitrogen	10313-039
Soro fetal bovino	Laboratórios PAA	Resposta 15-751
Penicilina / estreptomicina / neomicina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 15640-055
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Científico	25200056
Nanopartículas de prata (20nm)	Sigma-Aldrich	730793
Reagente de viabilidade celular PrestoBlue	Invitrogen	Rolamento A13262
Rato TNF-α ELISA Max Delux	Biolenda	430904
Lipopolissacarídeo	Sigma-Aldrich	L4391
Citrato de sódio	Sigma-Aldrich	S4641
equipamento
Placa inferior óptica de 96 W, poliestireno preto, tratada para cultura de células, com tampa, estéril	Thermo Fisher Científico	165305
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-0.5 com membrana Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
Microplaca multimodo SpectraMax M5	Dispositivos Moleculares	M5
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 50mL	Corning, Inc	Telefone: 14-432-22
Filtros de células Falcon 70 μm	Corning, Inc	08-771-2
Centrífuga de mesa 5430	Eppendorf	22620560