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1. Manutenção da Cultura de Células Microgliais
- Meio de cultura de células quentes (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN) a 37 °C.
- Obter estoque congelado de células microgliais BV2 na passagem 18 - 25 do armazenamento a -80 °C. Descongelar rapidamente as células em banho-maria a 37 °C.
- Transferir cuidadosamente as células para um balão de 75 cm2 com ventilação contendo 10 ml de meios de cultura celular.
- Incubar o balão em CO2 a 5% a 37 °C. Aspirar o meio após 24 horas e substituí-lo por meio novo. Cultive células até aproximadamente 70 - 80% de confluência.
2. Contagem e revestimento de células
- Em banho-maria a 37 °C, aqueça DMEM e solução de ácido 1x-tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA).
- Aspirar os meios das células e adicionar 500 μl de tripsina. Incube a 37 ° C por 2 a 5 min.
- Com a ajuda de um raspador, retirar as células do balão e suspendê-las em 5 ml de DMEM. Passar as células através de um filtro de 70 μm para um tubo de 50 ml três vezes.
- Conte as células usando um hemocitômetro e semeie 8.000 células/poço em uma placa de fundo transparente de parede preta em um volume final de 200 μl de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 °C por 24 horas.
- Remova o DMEM antigo e substitua-o por 200 μl de DMEM aquecido suplementado com 1% de PSN para soro, carente de microglia. Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 °C por 24 horas.
3. Ativando a Microglia
- Em tubos separados, diluir nanopartículas de prata (AgNPs) (0,01, 0,05 ou 0,1 μg/ml) e veículo/controle neutro (citrato de sódio, 0,04 mM) em DMEM sem soro suplementado com 1% de PSN até as concentrações finais de trabalho.
- Remover 100 μl de meio de cada alvéolo e substituir por 100 μl de composto de tratamento adequado.
- Incubar a placa em CO2 a 5 % a 37 °C durante 24 horas.
4. Filtrando mídia condicionada
- Coletar 200 μl de sobrenadante de meio de cada alvéolo e transferi-lo para um filtro (limite de peso molecular de 10 kDa) com tubo de coleta (capacidade de 1,5 a 2 ml).
- Centrifugue a 14.000 x g em temperatura ambiente por 15 min.
- Descarte o fluxo (sobrenadante com partículas) e coloque o filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de coleta.
- Centrifugue a 1.000 x g em temperatura ambiente por 2 min.
nota: O meio filtrado resultante (contendo citocinas secretadas) é concentrado seis vezes.
- Levar o volume do concentrado a 400 μl com DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN e conservar com gelo.
5. Manutenção da cultura de células hipotalâmicas
- Meio de cultura de células DMEM quente suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN a 37 °C.
- Obter um stock congelado de células hipotalâmicas (mHypo-A1/2) na passagem 18 - 25 armazenadas a 80 °C. Descongelar rapidamente as células num banho-maria a 37 °C.
- Transferir cuidadosamente as células para um balão de 75 cm2 com ventilação contendo 10 ml de meios de cultura celular.
- Incubar o balão em CO2 a 5% a 37 °C. Aspirar o meio após 24 horas e substituí-lo por meio novo. Cultive as células até que estejam aproximadamente em 70 - 80% de confluência.
6. Determinando a toxicidade das células hipotalâmicas
- Aquecer a solução de DMEM e 1x-tripsina-EDTA em banho-maria a 37 °C.
- Aspirar o meio das células hipotalâmicas e adicionar 500 μl de tripsina. Incubar a 37 °C durante 2 - 5 min. Remova as células do frasco usando um raspador, conforme descrito acima na etapa 2.
- Conte as células usando um hemocitômetro e células hipotalâmicas em placa a 5.000 células/poço em uma placa de fundo transparente de parede preta em um volume final de 200 μl de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de PSN, e incube durante a noite em 5% de CO2 a 37 ° C.
- Remova 100 μl de mídia antiga usando um pipetador multicanal e adicione 100 μl de mídia condicionada concentrada filtrada a uma concentração final de 1x.
- Incubar a placa em 5% de CO2 a 37 °C por 24 horas.
- Adicione 22 μl de reagente de resazurina e incube a placa por 20 min em 5% de CO2 a 37 ° C.
- Usando um espectrofotômetro multimodo, registre a fluorescência (560 nm EX / 590 nm EM) para medir a viabilidade celular. Relate os resultados como unidades de fluorescência relativa (RFU).