1. Preparação de Reagentes e Equipamentos
- Prepare 1x tampão de dissecção (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sacarose, 5 mM trealose, 5 mM de ácido hidroxietilpiperazina etano sulfônico [HEPES]; pH 7,2).
- Prepare 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Prepare 1x PBT usando 1x PBS com 0,01% de Triton X-100.
- Prepare placas de ágar suco de frutas.14 Resumidamente, misture 30 g de ágar em 700 mL de H2O e autoclave. Dissolva 0,5 g de metilparabeno em 10 mL de etanol e adicione a solução a 300 mL de concentrado de suco de frutas (uva ou maçã). Misture o concentrado em uma solução de ágar autoclavada e despeje nas tampas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm.
nota: A pré-mistura de ágar uva também pode ser adquirida de várias empresas (consulte a Tabela de Materiais).
- Obtenha pinças tamanho 5 que permitem ferir mecanicamente as larvas.
- Use aparelhos de anestesia padrão baseados em Drosophila CO2.
2. Selecionando larvas de Drosophila
- Tome um frasco ou frasco de Drosophila contendo larvas errantes de terceiro ínstar que foram cultivadas a 25 ° C.
- Selecione dez larvas individuais de 2º ou 3º ínstar com base na aparência. As larvas de terceiro ínstar podem ser identificadas pelo aparecimento de espiráculos anteriores ramificados, enquanto as larvas de segundo ínstar são menores e têm espiráculos anteriores mais semelhantes a tacos.
nota: Os estágios larvais também podem ser identificados pelo tempo. A 25 °C, as larvas do segundo ínstar aparecem aproximadamente 48 h após a eclosão, e as larvas do terceiro ínstar mudam aproximadamente 24 h depois. Se estiver interessado em examinar a neurodegeneração na JNM, as larvas de segundo ínstar precisam ser feridas.
3. Preparando larvas de Drosophila para lesões mecânicas
- Pegue cuidadosamente as larvas individuais com uma pinça ou um pincel, tomando cuidado para não comprimi-las de forma alguma.
- Coloque diretamente dez larvas em um prato de vidro contendo PBS 1X frio ou tampão de dissecação para remover quaisquer restos de comida e desacelerar a motilidade larval
.
4. Lesão mecânica e tratamento de larvas de Drosophila
- Coloque cada larva individual em um aparelho anestésico de CO2.
- Sob um microscópio de dissecação, role cuidadosamente cada larva em seu lado dorsal para visualizar os nervos segmentares através da cutícula.
- Posicione o tamanho 5 da pinça aproximadamente 1/2 a 2/3 do comprimento da larva, começando nos ganchos da boca. Uma vez posicionado, aperte aproximadamente 1/3 da cutícula ventral contendo os nervos segmentares com uma pinça tamanho 5.
- Para garantir que os nervos segmentares larvais sejam feridos, aplique força suficiente para esmagar os nervos segmentares, mas deixe a cutícula intacta. Para determinar a quantidade correta de força, esmague 10 larvas e certifique-se de que a taxa de mortalidade após 5 h esteja abaixo de 50%.
- Após a lesão, transfira cuidadosamente as larvas para uma placa de ágar suco de frutas contendo aproximadamente 0,5 g de pasta de fermento. Coloque cada larva de forma que sua extremidade anterior fique na pasta de fermento, para continuar alimentando-se apesar da motilidade interrompida.
nota: Para garantir que os nervos segmentares larvais tenham sido lesados, a motilidade larval interrompida pode ser observada após a transferência para a placa de ágar. As larvas feridas são efetivamente paralisadas posteriormente ao local da lesão, mas ainda podem mover seus ganchos bucais e se alimentar. Uma alta taxa de mortalidade de animais após ferimentos é comum, por isso é melhor ferir 20-50% mais animais do que o necessário para um experimento.
- Coloque placas de ágar contendo pasta de fermento e 10 larvas feridas no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, agora contendo as larvas feridas em uma placa de ágar com uma toalha de papel úmida, certificando-se de que a toalha de papel não toque nas larvas ou nas placas de ágar. Coloque esta placa de Petri em um recipiente hermético maior, à temperatura ambiente (RT).
- Recupere as larvas para dissecção após períodos especificados (6, 12 ou 24 h) após a lesão.
nota: Para examinar os efeitos imediatos da lesão no citoesqueleto axonal, as larvas podem ser dissecadas diretamente após a lesão. Para examinar os defeitos de transporte axonal, as larvas podem ser dissecadas aproximadamente 6 h após a lesão. Cerca de 12 h após a lesão, pode-se observar um acúmulo de proteínas ubiquitinadas e, 24 h após a lesão, pode ser observada degeneração dos neurônios motores na JNM.