Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Abstract

Fonte: Tietz, S. M. et al. Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e gliais da unidade neurovascular durante a encefalomielite autoimune experimental in vivo. J. Vis.(2019)

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao desenvolvimento de EAE.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Indução EAE

1. Anestesiar camundongos C57BL/6 com isofluorano usando um sistema vaporizador. Para induzir anestesia em camundongos, exponha o camundongo a 4,5% de isofluorano em oxigênio em uma pequena câmara de incubação antes de transferir o camundongo para uma máscara facial com 2,1% de isofluorano. Use uma unidade de anestesia equipada com uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia do camundongo.
2. Fixe o camundongo anestesiado em uma mão e primeiro injete 30 μL de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG) - peptídeo aa_35-55 (MOG_35-55) / emulsão adjuvante de Freund (CFA) completa por via subcutânea nos flancos das patas traseiras (Figura 1: 1 + 2; no total 60 μL; flanco esquerdo 30 μL e flanco direito 30 μL) nas proximidades dos gânglios linfáticos inguinais.
3. Coloque o camundongo de barriga para baixo e injete 20 μL de emulsão MOGaa_35-55 / CFA no tecido adiposo mole esquerdo e direito na raiz da cauda (Figura 1: 3 + 4; no total 40 μL; raiz da cauda do lado esquerdo 20 μL e raiz da cauda do lado direito 20 μL) e uma pequena gota de emulsão MOGaa_35-55 / CFA no pescoço do camundongo (Figura 1: 5).
4. Injete 100 μL de solução de toxina coqueluche (PTx) por via intraperitoneal no camundongo. Segure a cabeça do rato abaixo do centro do corpo para evitar a injeção no intestino.
5. Substituir a dieta de manutenção (nutrientes majoritários extrudados: proteína bruta 18,5%; gordura bruta 4,5%; fibra bruta 4,5%; cinza bruta 6,5%; amido 35%; energia metabólica: 13,1 MJ/kg) por dieta reprodutiva (nutrientes majoritários extrudados: proteína bruta 23,5%; gordura bruta 5,5%; fibra bruta 3%; cinza bruta 5,7%; amido 36%; energia metabólica: 14,3 MJ/kg) a fim de fornecer aos camundongos alimentos de maior conteúdo energético antes e durante a doença clínica esperada.
6. Remova a máscara facial e transfira o mouse para sua gaiola doméstica com uma almofada de aquecimento. Após 10 minutos, certifique-se de que o mouse esteja totalmente acordado e móvel.
7. Repita a injeção de PTx (etapa 1.4) 48 horas após o primeiro tratamento.

2. Pontuação de camundongos EAE

1. Verifique o estado de saúde dos camundongos EAE todas as manhãs, dando uma olhada dentro das gaiolas.
2. Marque os ratos EAE todas as tardes.
3. Retire cada camundongo individual incluído no experimento EAE da gaiola e verifique se a cauda tem tônus movendo-a para cima com um dedo. Um rato saudável manterá a cauda erguida (a cauda tem um tônus). Se o EAE clínico tiver começado, o tônus da cauda será mais baixo, visível por uma queda gradual da cauda. Eventualmente, o mouse não será capaz de levantar o rabo.
4. Coloque cada camundongo individual incluído no experimento EAE na bancada limpa e observe e documente o comportamento de caminhada. Consulte a Tabela 1 para obter os critérios de pontuação para a avaliação da gravidade da doença (pontuação EAE).
5. Avalie e documente o peso de cada camundongo incluído no experimento.
6. Para garantir a ingestão adequada de comida e água por camundongos que apresentam uma pontuação clínica EAE de 1, forneça alimentos umedecidos em um prato de plástico no fundo da gaiola e refresque diariamente.

Results

Figura 1: Representação gráfica dos locais de injeção para indução de EAE. 1) Local de injeção de 30 μL de emulsão MOG no flanco direito, 2) local de injeção de 30 μL de emulsão MOG no flanco esquerdo, 3) local de injeção de 20 μL de emulsão MOG na raiz da cauda esquerda, 4) local de injeção de 30 μL de emulsão MOG na raiz da cauda direita, 5) local da injeção para uma gota pequena da MOG-emulsão no...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimentos de criação	por exemplo, PROVIMI KLIBA SA	3336
Gaiolas ventiladas individualmente, linha azul tipo II ou III	por exemplo, Tecniplast	1145D, 1285L
Camundongos C57BL/6J fêmeas (8-12 semanas)	por exemplo, Janvier Labs		Mulheres, 8-12 semanas
Agulha de injeção de 18G x 11/2 '' (1,2 mm x 40 mm)	por exemplo, BD, BD Microlance 3	304622
Agulha de injeção 27G x 3/4'' – Nº 20 (0,4 mm x 19 mm)	por exemplo, BD, BD Microlance 3	Rolamento 302200
Agulha de injeção de 30G x 1/2'' (0,3 mm x 13 mm)	por exemplo, BD, BD Microlance 3	Rolamento 304000
Adjuvante de Freund incompleto (IFA)	por exemplo, Santa Cruz Biotecnologia	SC-24648	Armazenar a 4°C
Alimentos de manutenção	por exemplo, PROVIMI KLIBA SA	3436
Peptídeo MOGaa35-55	por exemplo, GenScript		Armazenar a -80 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RA	por exemplo, BD	231141	Conservar a 4 °C
NaCl 0,9 %	B. Braun	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	B. Braun	Rolamento 9151125S
Toxina da coqueluche	por exemplo, Liste laboratórios biológicos, Inc.	180	Conservar a 4 °C
Tesoura de ponto	F.S.T	15012-12
seringa 1 ml	por exemplo, PRIMO	62,1002
seringa 10 ml	por exemplo, CODAN Medical ApS	2022-05