Determinando a ruptura da barreira hematoencefálica usando corantes fluorescentes em um modelo de camundongo EAE

Resumo

Fonte: Tietz, S. M., et al., Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e gliais da unidade neurovascular durante a encefalomielite autoimune experimental in vivo. J. Vis. (2019).

Este vídeo demonstra um procedimento para avaliar a ruptura da barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo EAE. Corantes fluorescentes de diferentes tamanhos são injetados retroorbitalmente e circulam pelos vasos sanguíneos do cérebro. O corante menor vaza através de lacunas no tecido cerebral, enquanto o corante maior entra apenas se a ruptura for grave, correlacionando-se com a extensão do dano da barreira.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Ensaio de permeabilidade in vivo

1. Preparações de soluções:
   1. Para soluções de estoque de dextrano, dissolva 10 mg de 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488, bem como 3 kDa Dextran Texas Red em 500 μL de solução de cloreto de sódio a 0,9% (20 mg / mL).
   2. Para a solução de trabalho de dextrana, imediatamente antes da injeção pipete 55 μL de solução estoque de Dextran Alexa Fluor 488 de 10 kDa (20 mg / mL) em um pedaço de filme de vedação e adicione 55 μL de solução de estoque Texas Red de dextrana 3 kDa (20 mg / mL). Misture e colete 100 μL em uma seringa fina descartável (concentração final de 2 mg / 100 μL).
   3. Para a solução-mãe de formaldeído a 10% (Paraformaldeído ou PFA), combine 10 g de pó extra puro de PFA, 100 mL de PBS e 200 μL de hidróxido de sódio (NaOH) 1N em um béquer de vidro limpo e aqueça a precisamente 56 ° C sob agitação usando um agitador magnético. Conservar a 56 °C durante 30 min até que o PFA esteja completamente dissolvido. Resfrie até a temperatura ambiente, ajuste o pH para 7,4 e filtre com um filtro de papel. Conservar a 20 °C. A solução estoque pode ser diluída ainda mais usando solução salina tamponada com fosfato ou PBS.
2. Anestesiar brevemente camundongos C57BL/6 saudáveis ou camundongos C57BL/6 que sofrem de encefalomielite autoimune experimental, ou EAE com isoflurano (o camundongo será sedado por aproximadamente 1 min). Use um sistema automatizado (os camundongos serão expostos a 4,5% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de indução e depois transferidos para uma máscara facial com 2,1% de isoflurano).
3. Coloque o camundongo anestesiado em uma posição lateral sobre a mesa e, em seguida, injete por via intravenosa (por exemplo, retroorbitalmente) 100 μL de marcadores fluorescentes no camundongo antes que ele acorde.
4. Remova imediatamente a máscara facial e certifique-se de que o mouse esteja totalmente acordado e móvel após a curta anestesia. Deixe o marcador circular por 15 minutos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dextrano Alexa Fluor 488 (10.000 MW)	por exemplo, sondas moleculares	D22910	Armazenar a -20 °C; proteger da luz
Dextrano Texas Tinto (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Armazenar a -20 °C; proteger da luz
Alimentos de manutenção	por exemplo, PROVIMI KLIBA SA	3436
Paraformaldeído	Merck	Rolamento 30525-89-4
NaCl 0,9 %	B. Braun	3535789
Filme de vedação, por exemplo, Parafilm M	por exemplo, Sigma-Aldrich	Pág. 7793
seringa 1 ml	por exemplo, PRIMO	62,1002