Imunocoloração de tecidos craniofaciais de camundongos

Resumo

Fonte: Yang, J., et al., Preparação de Tecidos e Imunocoloração de Tecidos Craniofaciais de Camundongos e Ossos Não Descalcificados. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de criossecções de tecidos craniofaciais embrionários de camundongos, usando microscopia de fluorescência para avaliar a expressão de marcadores nucleares e determinar a proliferação celular e a atividade de sinalização.

Protocolo

Texto de isenção de responsabilidade: Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Coloração por imunofluorescência

1. Retire as lâminas a partir de -80 °C. Mantenha as lâminas em RT durante 1 h para secar as secas ao ar. Enxágue as lâminas em 0,1% de PBST (0,1% de éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol em PBS; consulte a Tabela de Materiais) três vezes por 5 min cada para lavar a OCT e permeabilizar as seções.
2. Opcionalmente, execute a recuperação do antígeno (opcional).
   1. Pré-aqueça o tampão citrato (10 mM de citrato de sódio pH 6) na mancha com um vaporizador ou banho-maria a 95–100 °C. Mergulhe as lâminas no tampão citrato e incube por 10 min.
   2. Retire a placa de coloração do vaporizador ou banho-maria e resfrie as lâminas em temperatura ambiente por 20 minutos ou mais15.
      nota: Como alternativas, use tampão Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) ou tampão EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) para recuperação de antígeno induzida por calor. Use uma panela de pressão, micro-ondas ou banho-maria para recuperação de antígenos induzida por calor, além do vaporizador quente. Uma recuperação de antígeno induzida por enzima usando tripsina ou pepsina é outra alternativa. Otimize a concentração e o tempo de tratamento da recuperação enzimática para evitar seções danosas. Otimize o método de recuperação de antígeno para cada combinação de anticorpo/antígeno.
3. Incubar cada lâmina com 200 μL de solução de bloqueio (soro de burro a 5% diluído em PBST a 0,1%) em RT por 30 min e, em seguida, remover a solução de bloqueio sem enxágue.
4. Incubar cada lâmina com 100 μL de anticorpo ou anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio por 1 h em RT ou O/N a 4 °C. Enxaguar as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada em RT.
5. Incubar cada lâmina com 100 μL de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio por 1 h em RT. Enxaguar as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada em RT. Proteger as lâminas da luz.
6. Montar slides.
   1. Adicione duas gotas de meio anti-desbotamento com DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) na lâmina. Em seguida, cubra com uma lamínula.
   2. Armazene a 4 °C no escuro até que esteja pronto para a imagem.
      nota: Como alternativa, rotule os núcleos com DAPI ou corante Hoechst 33324 diluído 1:2.000 em PBS em RT primeiro e, em seguida, monte com glicerol.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo secundário anti-coelho Alexa fluor 488-goat	Invitrogen	A-11034
Mountant antifade com DAPI	Invitrogen	Pág. 36931
Albumina de soro bovino	sigma	A2153
Lamínulas	Marca Fisher	12-545-E
Criostato	Leica	CM1850
Edta	sigma	E6758
Microscópio de fluorescência	Olimpo	BX51
Lâminas de microscópio	Marca Fisher	12-550-15
Composto OCT	Fisher Saúde	Telefone: 23-730-571
Paraformaldeído (PFA)	sigma	Pág. 6148
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	sigma	Pág. 4417
Éter terc-octilfenílico de polietilenoglicol	sigma	T9284	Tritão X-100
Anticorpo anti-Ki67 de coelho	Tecnologia de sinalização celular	Pedido 9129	Lote#:3; RRID:AB_2687446
Anticorpo anti-pSmad1/5/9 de coelho	Tecnologia de sinalização celular	Rolamento 13820	Lote#:3; RRID:AB_2493181
Citrato de sódio	sigma	1613859
Tris	sigma	10708976001