Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Abstract

Fonte: Tsuruta, F., et al. Quantificação de Motilidades de Endossomo e Lisossomo em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Protocol

1. Imagem da motilidade da vesícula

1. Prepare os plasmídeos que irão rotular cada tipo de vesícula. Por exemplo, use EGFP-Rab5 para endossomos iniciais, EGFP-Rab7 para endossomas tardios, LAMP-EGFP para lisossomos e EGFP-LC3 para autofagossomos.
   nota: Esses plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação da tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Normalmente, 3 a 5 dias in vitro (Divisão ou DIV) neurônios podem ser transfectados com esses plasmídeos usando reagentes de transfecção.
2. Misturar 4,0 μg de plasmídeos com 200 μL de meio isento de soro por pipetagem. Em um tubo separado, dilua 8 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais) em 200 μL de meio sem soro. Incube por 5 minutos em temperatura ambiente (RT).
3. Misture a solução de plasmídeo e a solução regente de transfecção na etapa 1.2 pipetando. Incubar por 20 min em RT.
4. Adicionar meio isento de soro e 400 μL da solução plasmidial da etapa 1.3 a cada placa de fundo de vidro revestida contendo neurônios corticais do meio de cultura cortical cerebral. Incubar os neurônios a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} por 30 min. Substitua o meio por 2 mL de meio de cultura cortical cerebral. Incubar os neurônios a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% por 1-2 dias.
   nota: Prepare um meio de cultura cortical cerebral consistindo de meio basal de neurônios suplementado com 1x suplementos de B-27, 2 mM de L-glutamina e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
5. Após 1 a 2 dias de transfecção, selecione as células transfectadas para aquisição de imagem.
   nota: Neurônios prematuros menores que 7 DIV têm tendência a exibir motilidade vesicular dinâmica. Selecione neurônios que expressem moderadamente a sonda de fluorescência porque imagens claras não podem ser obtidas quando um neurônio altamente expressor é selecionado. Além disso, selecione uma forma neuronal típica, como neurônios piramidais, que possuem axônios longos e dendritos intrincados, para facilitar a identificação do axônio e dos dendritos (ver Figura 1A).
6. Aquisição de imagem usando um sistema de imagem com lapso de tempo: Para imagens, use um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera Charge-Coupled Device (CCD) com lentes objetivas 40X Plan Apo 0.95NA ou 100X Plan Apo VC NA1.4. Controlar a temperatura a 37 °C utilizando um sistema de incubação. Adquira imagens de neurônios em um quadro/5 s durante um período de 100 s controlado pelo software de aquisição de imagem. Como alternativa, adquira imagens em intervalos mais curtos e por períodos de tempo mais longos, como em um quadro por 2 s em um período de 300 s.
   nota: Uma variedade de aplicativos está disponível para obter imagens sequenciais, muitas das quais seriam adequadas para esse método. Portanto, nenhuma aplicação específica é recomendada; em vez disso, cada pesquisador deve usar qualquer aplicativo disponível.

2. Análise de imagem

1. Abra todas as imagens sequenciais no software ImageJ com o Manual Tracking.
   nota: Até o momento, o Rastreamento Manual tem sido amplamente utilizado em experimentos de rastreamento. O rastreamento manual foi desenvolvido pelo Dr. Fabrice Cordelières. Instruções escritas detalhadas estão disponíveis online. Para a análise, a qualidade dos dados de imagem é melhorada com um número suficiente de imagens. Recomenda-se usar mais de 20 imagens.
2. Para combinar as imagens sequenciais, escolha→ → . Clique.
3. Escolha → ; uma janela de rastreamento aparecerá.
4. Clique na caixa de seleção e defina os parâmetros de rastreamento na seção de parâmetros.
   nota: Vários parâmetros podem ser definidos, incluindo intervalo de tempo, calibração x/y, calibração z, tamanho do quadrado de pesquisa para centralização, tamanho do ponto, largura da linha e tamanho da fonte. Neste ensaio simplificado, foram definidos o intervalo de tempo e a calibração x/y. Em outras circunstâncias experimentais, pode ser necessário definir outros parâmetros também. Os parâmetros usados aqui são os seguintes: o é de 5 s e o é de 0,26642 μm para uma lente objetiva 40X Plan Apo 0,95NA ou 0,10657 μm para uma lente objetiva 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. Depois que os parâmetros forem definidos, clique em para iniciar uma nova faixa.
6. Depois de determinar as vesículas de interesse (por exemplo, as vesículas indicadas pelas pontas das setas azuis e vermelhas na Figura 1A (painel direito)), clique no centro dos sinais nas imagens sequenciais para registrar as coordenadas xy. Os resultados das coordenadas xy, distância e velocidade registradas aparecem em uma nova janela.
   nota: No caso dos lisossomos, grandes sinais fluorescentes brilhantes (por exemplo, Figura 1A (painel direito), ponta de seta laranja) são freqüentemente observados nos neurônios. Esses sinais ocasionalmente exibem vesículas acumuladas ou varicosidades patológicas, portanto, esses sinais devem ser evitados para quantificar a motilidade.
7. Repita a etapa 2.6 para coletar as coordenadas xy das vesículas de todas as imagens sequenciais; depois que o ponto de referência é selecionado, cada imagem avança automaticamente para a imagem sucessiva.
8. Exporte esses dados para uma nova tabela (por exemplo, uma planilha). Use o software apropriado para criar um gráfico adequado (consulte a Tabela de Materiais).
   nota: Para analisar os dados, selecione a coluna, some todos os valores dessa coluna e mostre uma distância de motilidade como um gráfico de barras, como na Figura 1B. Além disso, repita esta etapa, calcule a média da distância total da motilidade e mostre como um gráfico de barras, como na Figura 1C. O software para criar um gráfico de barras e dados de forma de onda é mostrado na Tabela de Materiais.

Results

Figura 1: Motilidade dos lisossomos em dendritos neuronais. (A) Neurônios corticais de camundongos (4 DIV) foram transfectados com plasmídeo LAMP-EGFP por 2 dias. Esta imagem mostra a motilidade das vesículas contendo LAMP-EGFP nos dendritos. A inserção mostra a imagem de lapso de tempo das vesículas positivas para LAMP-EGFP. A ponta da seta vermelha indica uma vesícula em movimento e a ponta da seta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio neurobasal	Thermo Fisher	Rolamento 21103-049
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Meio livre de soro
Penicilina estrepticina	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
Suplementos B-27	Thermo Fisher	17504044
bromidrato de poli-D-lisina	sigma	Pág. 7280
poli-L-ornitina	sigma	Pág. 4957
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher	11668027	Reagente de transfecção
Polietilenoimina "Max"	Policiências	Rolamento 24765	Reagente de transfecção. Como alternativa ao Lipofectamine2000, está disponível 0,1 mg / ml de polietilenoimina dissolvida em água esterilizada. Mas é baixa eficiência e alta toxicidade.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	NA
Sistema de incubação INUG2-K13	Tokay acertou	NA
GraphPad Prism versão 6.0	Software GraphPad	NA
Excel versão 15	Microsoft	NA
Versão 1.47	NA	NA