Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Imunofluorescência
- Prepare soluções incluindo o tampão de bloqueio, tampão de anticorpos, tampão de lavagem 1 e tampão de lavagem 2 (consulte a Tabela 1).
- Enxágue as fatias uma vez com tampão fosfato (PB) para remover o excesso de composto de temperatura de corte ideal (OCT).
- Remova a solução com uma pipeta de plástico sem sugar as fatias de cérebro. Adicione 250 μL de PB fresco com uma pipeta de 1000 μL.
cuidado: As fatias não devem secar, então remova e adicione bem os líquidos.
- Remova o PB com uma pipeta de plástico e adicione 250 μL de tampão de bloqueio por poço com uma pipeta de 1000 μL. Incubar durante 3 h à temperatura ambiente (RT) no shaker.
- Durante o tempo de incubação, diluir os anticorpos primários em tampão de anticorpos num tubo de reacção. Use 250 μL de tampão de anticorpos por alvéolo e adicione a quantidade apropriada de anticorpo (ver Tabela 2) pipetando-o diretamente na solução usando uma pipeta de 2 μL. Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Vortex logo depois para garantir a mistura adequada.
nota: Para determinar a fluorescência de fundo, a coloração também deve ser realizada sem adição do anticorpo primário. Para isso, incubar a fatia em solução de anticorpos sem anticorpos primários de acordo com o protocolo.
- Após o tempo de incubação, remova o tampão de bloqueio com uma pipeta de plástico e adicione 250 μL de solução de anticorpos contendo anticorpos primários por alvéolo. Incubar fatias com anticorpo primário durante a noite a 4 °C num shaker.
- No dia seguinte, lave as fatias com tampão de lavagem 1 3x por 10 min em RT em uma coqueteleira.
- Remova o meio com uma pipeta de plástico e adicione 300 μL de tampão de lavagem 1 por poço. Incubar em RT por 10 min. Repita 3 vezes.
- Durante as etapas de lavagem, diluir os anticorpos secundários acoplados ao fluoróforo em tampão de anticorpos em um tubo de reação. Use 250 μL de tampão de anticorpos por alvéolo e adicione a quantidade apropriada de anticorpo (ver Tabela 2) pipetando-o diretamente na solução usando uma pipeta de 2 μL. Misture a solução pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Vortex logo depois para garantir a mistura adequada.
cuidado: Como os anticorpos são sensíveis à luz, todas as etapas a partir deste ponto precisam ser realizadas no escuro.
- Após as etapas de lavagem, remova o tampão de lavagem com uma pipeta de plástico e adicione 250 μL de solução de anticorpos contendo anticorpos secundários por alvéolo. Incubar as fatias com anticorpo secundário durante 90 min a RT no escuro.
- Lave as fatias com tampão de lavagem 2 3x por 10 min em RT.
- Durante as etapas de lavagem, dilua 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 0,1 M PB na concentração de 1:2000.
- Remova o tampão de lavagem 2 com uma pipeta de plástico e adicione 250 μL de solução DAPI por poço. Incube por 5 min em RT no shaker.
- Remova a solução DAPI com uma pipeta de plástico e adicione 500 μL de 0,1 M PB por poço com uma pipeta de 1000 μL.
- Monte fatias em lâminas de microscópio.
- Coloque uma lâmina de microscópio sob o estereoscópio. Com um pincel fino, adicione três gotas separadas de 0,1 M PB na lâmina. Coloque uma fatia por gota na lâmina do microscópio.
- Use o pincel fino para achatar e orientar as fatias na lâmina do microscópio.
- Quando todas as fatias estiverem posicionadas corretamente, remova o excesso de PB com um lenço de papel e seque a lâmina com cuidado.
cuidado: Evite secar completamente as fatias do cérebro.
- Adicione 80 μL de meio de incorporação na lâmina. Abaixe cuidadosamente a lamínula na lâmina, incorporando assim as fatias de cérebro.
- Deixar as lâminas secarem na hotte durante 1-2 h (cobri-las para evitar a exposição à luz) e guardá-las numa caixa de lâminas de microscópio a 4 °C.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Exames de imagem
- Depois que o meio de incorporação estiver completamente endurecido, coloque a lâmina do microscópio sob o microscópio confocal.
nota: A microscopia de epifluorescência combinada com software de deconvolução deve produzir qualidade de imagem semelhante.
- Ajuste as configurações do laser aumentando ou diminuindo a intensidade do laser para cada canal para que poucos pixels sejam superexpostos para garantir a distribuição máxima dos valores de cinza.
- Adquira tecidos virtuais de toda a fatia do cérebro para os diferentes canais.
- No software de imagem, selecione a opção Tiles e delineie manualmente a fatia do cérebro com a Configuração da região do tile.
- Distribua pontos de suporte por toda a região do bloco e ajuste o foco para os diferentes pontos de suporte pressionando Verificar regiões/posições do bloco....
- Ajuste as configurações no Modo de Aquisição de acordo com a resolução desejada e o tamanho do arquivo da imagem resultante e inicie a digitalização.
- Quando a digitalização for concluída, use a função Costura para processar o tecido virtual. Exporte o arquivo como um .tif com a função Exportação de imagem.
3. Análise Baseada em Computador
- Carregue todos os canais individuais de uma imagem em FIJI clicando em Arquivo| Aberto.
- Com a ferramenta de seleção à mão livre, delineie um hemisfério no canal DAPI. Crie uma máscara da seleção clicando em Editar| Seleção| Criar máscara.
- Determine a intensidade média de fluorescência para os canais únicos (Mover e sinaptofisina) clicando em Analisar| Medida.
nota: Certifique-se de selecionar os diferentes canais para determinar os valores médios de intensidade de fluorescência para cada canal.
- Copie a intensidade média de fluorescência para os canais individuais em uma planilha.
- Determine a intensidade média de fluorescência para os canais individuais em uma área de interesse, delineando a área também com a ferramenta de seleção à mão livre. Use um atlas do cérebro de camundongo como referência.
- Repita as etapas 3.1 a 3.5 para todos os hemisférios e todas as áreas de interesse.
nota: Determine os valores para cada hemisfério separadamente para depois comparar os valores em uma área de interesse com os do hemisfério (consulte a etapa 4.2).
4. Tratamento de dados
- Caso a fluorescência de fundo seja alta, pode ser necessária uma subtração de fundo. Para isso, determine a intensidade média de fluorescência para a fatia processada sem anticorpo primário contra a proteína de referência (aqui: sinaptofisina) e subtraia esse valor de todos os valores obtidos para as regiões e hemisférios cerebrais.
- Quando as intensidades médias de fluorescência para os canais individuais para cada hemisfério e cada área de interesse tiverem sido determinadas (ver Tabela 3), calcule a razão entre Mover e sinaptofisina dividindo o valor de Mover pelo valor de sinaptofisina (amarelo na Tabela 3). Execute esta ação para cada hemisfério e cada área de interesse separadamente.
- Divida a razão obtida para uma área de interesse pela razão obtida para o hemisfério correspondente (laranja na Tabela 3) para determinar a razão da área de interesse para o hemisfério.
- Para determinar a abundância relativa do Mover, traduza a razão obtida em 4.2 em uma porcentagem, determinando seu desvio de 1 (vermelho na Tabela 3). Uma proporção de 1,25 daria, portanto, uma abundância relativa de Mover de 25% acima da média, e uma proporção de 0,75 produziria uma abundância relativa de Mover de 25% abaixo da média.
Tabela 1: Soluções utilizadas neste protocolo.
| Fixador (500mL) |
Misture 20g de paraformaldeído (conc. total: 4%)
50 mL 10x solução estoque PBS (conc. total: 1x)
450 mL bid H2OAdjust pH a 7,4 com NaOH
Nota: Para resolver o paraformaldeído em PBS, aqueça a solução. Não aqueça acima de 70 oC, pois o PFA se desintegra em temperaturas superiores a 70 oC.
Cuidado: O PFA é tóxico, potencialmente cancerígeno e teratogênico. Use luvas ao trabalhar com PFA e trabalhe sob a hotte. Evite a ingestão. |
| 0.1M PB (1L) |
Solução de estoque X
35,61 g Na2HPO4,2H 2O em 1 L bidest H2O | Solução de estoque Y
27,60 g NaH2PO4,2H 2O em 1 L bidest H2O |
Misture 385 mL de solução-mãe X
115 mL de solução estoque Y
500 mL bid H2O |
| Tampão de bloqueio (50 mL) |
Misture 1,25 mL de soro de cabra normal (concentração total: 2,5%)
1,25 mL de soro normal de burro (conc. total: 2,5%)
0,5 mL de surfactante não iônico (Triton-X100, conc.: 1%)
47 mL 0,1 M PB |
| Tampão de anticorpos (50 mL) |
Misture 0,25 mL de soro de cabra normal (concentração total: 0,5%)
0,25 mL de soro normal de burro (concentração total: 0,5%)
0,1 mL de tensoativo não iônico (conc. total: 0,2%)
49,4 mL 0,1 M PB |
| Tampão de lavagem 1 (50 mL) |
Misture 1 mL de soro de cabra normal (concentração total: 2%)
49 mL 0,1 M PB |
| Tampão de lavagem 2 (50 mL) |
Misture 0,5 mL de soro de cabra normal (concentração total: 1%)
49,5 mL 0,1 M PB |
Tabela 2: Anticorpos utilizados neste protocolo.
| Anticorpos primários |
| Dirigido contra | Espécies hospedeiras | RRID | concentração |
| Motor | coelho | AB_10804285 | 1:1000 |
| Sinaptofisina | cobaia | AB_1210382 | 1:1000 |
| Anticorpos secundários |
| Espécies-alvo | Espécies hospedeiras | Fluoróforo | concentração |
| coelho | burro | AlexaFluor 647 | 1:1000 |
| cobaia | cabra | AlexaFluor 488 | 1:1000 |
Tabela 3: Exemplo de tratamento de dados.
| Hemisfério |
| Hemisfério # | Intensidade média de fluorescência Sinaptofisina (U.A.) | Intensidade média de fluorescência Mover (UA) | Razão Mover/Sinaptofisina | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Hipocampo |
| Hemisfério # | Intensidade média de fluorescência Sinaptofisina (U.A.) | Intensidade média de fluorescência Mover (UA) | Razão Mover/Sinaptofisina | Razão para hemisfério | Abundância relativa do motor (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1,083
=D12/D4 1,057
=D13/D5 1,022
=D14/D6 0,965
=D15/D7 1,105
=D16/D8 1,051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5,064 |
