Avaliação da integridade estrutural das junções neuromusculares do músculo longitudinal dorsal em Drosophila

Resumo

Fonte: Sidisky, J. M., et al. Visualizando a degeneração sináptica em Drosophila adulta em associação com neurodegeneração. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um protocolo para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares nos músculos dorsais longitudinais de Drosophila. O procedimento envolve a coloração de neurônios e músculos com dois anticorpos distintos e a comparação de padrões de fluorescência entre moscas mutantes e selvagens. Uma redução na coloração neuronal em moscas mutantes indica neurodegeneração, enquanto a estrutura muscular permanece intacta.

Protocolo

1. Congelamento instantâneo e bissecção do tórax

1. Antes de iniciar as bissecções, encha um frasco Dewar com nitrogênio líquido usando luvas crioprotetoras adequadas e óculos de segurança. Obtenha um quebra-lâminas, lâminas de penas, um par de pinças finas, gelo, 1x PBS gelado e pinças criogênicas.
2. Prepare um balde de gelo para manter 1x PBS gelado.
3. Use o quebra-lâmina para agarrar a lâmina de pena em um ângulo e dobre a lâmina para quebrar um pequeno pedaço. O disjuntor da lâmina pode então travar a lâmina na posição para uso como um bisturi pequeno.
   nota: Uma lâmina deve durar para todos os grupos. Troque se a lâmina quebrar ou ficar cega.
4. Adicione uma ponteira de pipeta limpa ao P200 e remova 1/5 da ponteira para transportar as amostras.
5. Prepare um novo tubo de microcentrífuga para cada grupo e adicione 200 μL de 1x PBS a cada tubo. Este segundo tubo será usado para coletar as preparações finais do DLM.
6. Remova todos os 1x PBS dos tubos usando uma pipeta Pasteur.
7. Usando equipamento de proteção adequado, mergulhe o tubo no frasco de nitrogênio líquido por 10 s com a pinça criogênica.
   nota: Os tubos devem ser bem fechados para evitar que o tubo exploda.
8. Remova o tubo do nitrogênio líquido e adicione aproximadamente 300 μL de 1x PBS gelado às amostras com uma pipeta Pasteur. Mantenha as amostras no gelo.
9. Adicione 1x PBS gelado à placa de dissecção de 10 cm revestida com elastômero de silicone e dispense o primeiro tórax com a pipeta modificada de 200 μL.
10. Coloque o lado ventral do tórax para cima. Em uma mão, use um par de fórceps maçante para posicionar o tórax e, na outra, use um par fino de fórceps para remover parte do gânglio torácico para expor a linha média do tórax.
11. Use a linha média do tórax como guia para fazer um corte raso em 1/3 do tórax com a lâmina.
12. Remova a lâmina do tórax e posicione o tórax em um ângulo de 45° com a pinça romba. Reinsira a lâmina e corte diretamente na linha média do tórax. Isso resultará em dois hemitórax.
13. Pegue um hemitórax de cada vez e remova o excesso de tecido sob a fibra muscular DLM F (Figura 1B), a fibra mais ventral. Use a lâmina para fazer cuidadosamente um ou dois cortes para remover o excesso de tecido sem danificar os DLMs.
14. Uma vez isolado, transfira o hemitórax para o tubo correto com 1x PBS.
15. Repita as etapas 1.6 a 14.14 até que 10 hemitórax dissecados por grupo sejam feitos.

2. Coloração estrutural

1. Depois de dividir as amostras de tórax, coloque o tecido em tampão de bloqueio (1x PBS com soro de cabra normal a 0,1% e Triton X-100 a 0,2% em pH 7,4) para permeabilizar o tecido e evitar manchas inespecíficas. Use uma pipeta Pasteur para remover o excesso de 1x PBS e adicione 1,5 mL de tampão de bloqueio a cada tubo. Bloquear os tecidos durante, pelo menos, 1 h a 4 °C.
2. Prepare as amostras para coloração estrutural usando um anticorpo conjugado fluorescente, peroxidase de rábano 488 (anti-HRP-488) em uma diluição de 1:200 e Faloidina-647 em uma diluição de 1:1000 em tampão de bloqueio para corar neurônios motores e tecido muscular, respectivamente. Faça corante suficiente para ter 150 μL por tubo. Conservar a mancha a 4 °C coberta com papel alumínio ou numa caixa escura até estar pronta para a coloração.
3. Após o bloqueio, remova o excesso de tampão de bloqueio com uma pipeta de vidro Pasteur.
4. Antes de dispensar a mancha estrutural, bata a mancha. Adicione 150 μL da mancha a cada tubo. Coloque as amostras em uma caixa escura no rotador em temperatura ambiente por 2 h.
5. Remova a mancha e lave os tecidos quatro vezes em 1,5 mL de temperatura ambiente 1x PBS com 0,3% de Triton X-100 por 5 min no rotador em uma caixa escura. As amostras agora estão prontas para serem montadas em uma lâmina.

3. Tecido de montagem

1. Depois de lavar as amostras em PBST, prepare uma lâmina de microscópio para montar o tecido para coloração. Prepare suprimentos adicionais, incluindo lamínulas de vidro, uma pipeta P200, pontas de pipeta de 200 μL, tesouras, reforços transparentes, pinças de borda reta, mídia de montagem fluorescente antidesbotamento, esmalte e uma caixa escura para cobrir as lâminas.
2. Rotule o slide para identificar as amostras e limpe-o com lenços umedecidos para remover quaisquer manchas.
3. Para garantir que a lamínula não danifique as amostras de hemitórax, construa uma "ponte" usando etiquetas de reforço. Corte uma etiqueta de reforço ao meio e coloque cada metade com aproximadamente 15 mm de distância. Esta distância deve ser menor que a largura da lamínula. Repita esta etapa quatro vezes para completar uma "ponte" com 5 rótulos de altura.
4. Pegue a pipeta P200 e modifique uma ponteira cortando 1/5 da ponteira para transferir as amostras para a lâmina. As amostras devem ser transferidas para a lâmina no centro da ponte.
5. Pegue a borda de um lenço de laboratório e remova qualquer excesso de PBST. Usando uma pinça, organize os DLMs de forma que todas as amostras fiquem voltadas para o lado do músculo para cima e para o lado da cutícula para baixo.
6. Usando uma ponta de pipeta P200 padrão, aplique 70 μL de mídia de montagem na lâmina, evitando bolhas de ar. Dispense a mídia em um padrão circular dentro dos reforços, começando de fora para o centro.
7. Coloque uma lamínula sobre os reforços.
8. Use esmalte para revestir as bordas externas ao redor do perímetro da lamínula. Aplique generosamente para formar uma vedação completa do tecido.
9. Coloque a lâmina em uma superfície plana no escuro, deixando secar por pelo menos 10 minutos e evite o fotobranqueamento ou a perda de fluorescência. Os slides agora podem ser usados para imagens imediatamente ou armazenados em uma pasta de slides a -20 ° C para visualização posterior.

Resultados

Figura 1: Denervação progressiva de sinapses DLM em um modelo de Drosophila de ELA. (A) A geração de moscas transgênicas ALS expressando uma forma mutante humana de proteína de ligação ao alcatrão de 43 kDa (TDP-43) é mostrada no esquema. (B) A ilustração mostra a forma e a orientação de um hemitórax em uma Drosophila adulta. Usando o protocolo, pod...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
32% de formaldeído	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 15714	Preservação de tecidos
BenchRocker	Genesee Científico	31-302	Amostras rotativas durante a coloração
Quebrador de lâminas	Ferramentas de Belas Ciências	10053-09	Usado para segurar a lâmina de penas
lamínulas	Fisher Científico	12548UMA	Para montagem de tecido
luvas criogênicas	VWR	Rolamento 97008-198	Proteja as mãos do nitrogênio líquido
pinças criogênicas	VWR	82027-432	Segure o tubo de 2,0 mL em nitrogênio líquido
frasco dewar-1900 mL	Thomas Científico	5028M54	Segure nitrogênio líquido
Lâminas de penas	Ciências da Microscopia Eletrônica	72002-01	Lâminas de bisturi
Forecps finos x 2	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20	Um par fino para limpar a linha média do tórax. O outro par pode ser embotado com uma pedra de amolar.
anti HRP conjugado com FITC	Laboratórios Jackson	123-545-021	Cora os neurônios motores. Usado na concentração de 1:100
caixa de congelamento (Preto)	Fisher Científico	14100F	Protege as amostras da luz
pipetas de pasteur de vidro	VWR	Rolamento 14637-010	Usado para transferir amostras
corrediças de vidro	Fisher Científico	12550143	Para montagem de tecido
Mídia de montagem (VectaShield) anti-desbotamento	VWR	Rolamento 101098-042	A mídia de montagem retém a sinalização fluorescente
esmalte	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 72180	Lâminas de microscópio de vedação
soro de cabra normal	Fisher Científico	PCN5000	Previne a ligação não específica de anticorpos
Pincel	Genesee Científico	Rolamento 59-204	Transferindo moscas
Pbs	Fisher Científico	10-010-023	Solução salina para dissecação e coloração
Faloidina 647	Abcam	AB176759	Cora F-Actina no tecido muscular. Usado na concentração de 1:1000
placa de Petri de plástico (100 mm)	VWR	Rolamento 25373-100	Prato de dissecação
Etiquetas de reforço	W.B. Pedreiro	AVE05722	Fornece suporte para lamínula de vidro sobre o tecido montado
bloco de afiação	Grainger	1RDF5	Mantendo o fórceps fino afiado e também embotando o par separado
Pasta de slides	VWR	Rolamento 10126-326	Armazenamento de amostras
tesoura de escritório padrão	W.B. Pedreiro	ACM40618	Corte de etiquetas de reforço
Sylgard 184	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 24236-10	Revestimento para prato de dissecação
Tritão-X-100	Ciências da Microscopia Eletrônica	22140	Ajuda a permeabilizar o tecido
Sissors de Disssecção Vannas	Ferramentas de Belas Ciências	1500-00	Ued para remover as pernas da mosca e fazer uma incisão no tórax