Investigando uma lesão cerebral larval de peixe-zebra usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura em larga escala

Resumo

Fonte: Kuipers, J. et al., Microscopia eletrônica de transmissão de varredura em larga escala (nanotomia) de cérebro de peixe-zebra saudável e ferido.J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra um método para investigar lesões cerebrais em larvas de peixe-zebra usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) em larga escala, uma técnica que combina elementos de microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para produzir imagens de alta resolução. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação de amostras e na aquisição de imagens STEM de alta resolução para identificar lesões cerebrais.

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Fixação e Incorporação
   1. fixação
      1. Anestesiar larvas de peixes em tricaína (0,003%) adicionada à água de peixe-zebra E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) e testar a profundidade da anestesia cutucando suavemente com uma ponta de pipeta de 200 μl sob microscópio de dissecção até que o movimento não seja mais detectado (Figura 1A).
      2. Ao processar amostras para microscopia eletrônica (EM) correlativa após adquirir dados de imagem in vivo usando imagens confocais ou de 2 fótons em agarose a 1,8%, conforme descrito, fixe as larvas em agarose usando paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Triton-X-100 (0,05%).
      3. Corte as larvas da agarose e processe para EM em grande escala.
      4. Fixar as larvas em paraformaldeído fresco a 4% em PBS contendo Triton-X-100 (0,05%) por 2 horas em temperatura ambiente em tubos plásticos.
         nota: As células cultivadas em cultura (in vitro) podem ser fixadas diretamente no glutaraldeído, conforme descrito na etapa seguinte (1.1.1.5).
      5. Remova a solução e adicione 100 μl de PFA a 0,5%, glutaraldeído (GA) a 2% e cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4). Conservar durante a noite a 4 °C. Enxaguar as amostras duas vezes em cacodilato de sódio 0,1 M.
      6. Corte as cabeças das larvas rostralmente ao rombencéfalo para facilitar a penetração do ósmio. Use seringas / fórceps finos.
      7. Larvas pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1% (OsO₄) / ferrocianeto de potássio a 1,5% (K₄ [Fe (CN) ₆]) em cacodilato de sódio 0,1 M em gelo por 2 horas e enxágue 3 x 5 min em H₂O duplamente destilado.
      8. Desidratar em etanol por 20 min incubações em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 3 vezes 100%).
   2. Incorporação
      1. Prepare a resina epóxi de acordo com as receitas padrão usadas nos laboratórios EM.
         nota: Usamos resina epóxi da seguinte forma: misture 19,8 g de éter glicídico 100, 9,6 g de anidrido de ácido 2-dodecenilsuccínico e 11,4 g de anidrido metilnádico usando um agitador magnético. Adicione 0,5 g de DMP-30 (tris-(dimetilaminometil) fenol) e misture novamente.
      2. Incubar larvas durante a noite em resina epóxi a 50% em etanol (v/v) durante a rotação (RT).
      3. Substitua a resina epóxi diluída por resina pura. Incube por 30 min, adicione resina fresca novamente e incube por mais 30 min. Novamente, refresque a resina e incube 3 horas em RT, seguido por 15 min a 58 ° C e mais 1 hora em RT sob baixa pressão (200 mbar).
      4. Oriente as cabeças em moldes de incorporação plana de silicone disponíveis comercialmente sob um microscópio de dissecação usando uma agulha ou palito de dente com a parte anterior voltada para o lado do molde ou conforme necessário (Figura 1B).
      5. Polimerizar a resina epóxi durante a noite a 58 °C. Se a resina epóxi ainda estiver muito mole, deixe outro dia polimerizar e endurecer a 58 °C. Teste a rigidez aplicando pressão usando uma pinça. Se isso deixar facilmente um recuo, deixe outro dia polimerizar e endurecer a 58 ° C. Quando a amostra estiver totalmente endurecida, prossiga para o corte e seccionamento.
      6. Apare o excesso de resina do toco usando lâminas de barbear (Figura 1B).
2. Seccionamento, contraste e montagem
   1. Corte
      1. Corte o bloco de resina epóxi usando um ultramicrótomo.
      2. Use uma faca de vidro ou uma histofaca de diamante para cortar seções semifinas (500 nm) para coloração com azul de toluidina/fucsina básica (Figura 1D) para detectar o posicionamento correto.
      3. Transferir secções semifinas em lâminas microscópicas, recolhendo-as com uma pipeta de vidro Pasteur cuja ponta tenha sido fechada por fusão numa chama. Seque em uma chapa quente até que não haja mais água. Manchar por 10 segundos com azul de toluidina a 1% em água em uma placa quente e, após enxaguar com água, corar por 10 segundos com fucsina básica a 0,05% em tetraborato de sódio a 1%. Examine com um microscópio de luz normal de 10X a 40X.
      4. Quando o local/orientação adequado dentro do cérebro for alcançado, continue seccionando o bloco de resina epóxi com uma faca de diamante para cortar seções ultrafinas (~ 70 nm; Figura 1E)
      5. Use estruturas anatômicas facilmente identificáveis dentro e ao redor do cérebro, incluindo fossas olfativas, olhos e limites da substância cinza-branca, para identificar a região de interesse durante a seccionamento ultrafino e para ajustar o ângulo de corte quando a amostra é inclinada.
      6. Monte a seção em grades de cobre L2 x 1 de slot único (Figura 1F), para permitir a aquisição sem interrupções por barras de grade. Use grades revestidas com Formvar para apoiar as seções.
   2. contrastante
      1. Manchar seções ultrafinas em grades por 2 min em acetato de uranila a 2% em metanol, seguido de citrato de chumbo Reynolds por mais 2 min.

2. Aquisição de Imagens

1. Microscopia eletrônica de transmissão de varredura em larga escala (STEM)
   nota: Usamos o EM de varredura com um gerador de varredura externo capaz de adquirir vários campos de visão grandes em alta resolução usando a detecção STEM. Normalmente, uma imagem gerada dessa maneira é equivalente aos campos de visão de ~ 100 imagens de microscópio eletrônico de transmissão (TEM), reduzindo significativamente a quantidade de costura.
   1. Montagem de amostra no microscópio
      1. Coloque a grade com a seção no suporte de amostra de grade múltipla e transfira para a câmara do SEM.
   2. Alinhamento do detector STEM
      1. Coloque a grade com a amostra sob o feixe e mova-a para cima para que fique a aprox. 5 mm do pólo da lente. Adquira uma imagem a 20 kV usando o detector na lente.
      2. Concentre-se na borda da grade e ajuste a distância de trabalho para 4,0 mm.
      3. Mova o porta-amostras para uma posição segura e traga o detector STEM.
      4. Centralize o orifício do detector STEM no campo da imagem girando os parafusos de ajuste durante a imagem na velocidade máxima com o detector na lente.
      5. Com cuidado, traga de volta o suporte de amostra que se encaixará entre o pólo da lente e o detector.
      6. Adquira uma imagem com o detector na lente para garantir que ela esteja na área da seção.
      7. Mude para a detecção STEM (ganho médio e todos os quadrantes definidos em 'menos'), adquira uma imagem e selecione a área a ser digitalizada.
      8. Aumente a tensão de aceleração para 21 kV e aguarde a estabilização do feixe (imagem estável novamente), depois vá para 29 kV em etapas de 2 kV.
   3. Aquisição de imagens
      1. Pré-irradie a amostra (para evitar alterações de brilho causadas pelo feixe eletrônico) diminuindo o zoom para que toda a área a ser digitalizada caiba na janela da imagem.
      2. Altere a abertura para 120 μm (para manter a faixa dinâmica adequada, os ganhos do detector devem ser reduzidos em um passo).
      3. Desfoque para que a imagem fique desfocada.
      4. Torne a área digitalizada o mais compacta possível usando a opção de digitalização de área reduzida.
      5. Defina a velocidade de digitalização de forma que um quadro seja digitalizado em aprox. 1 - 2 seg.
         nota: Dependendo do tamanho e do tecido, isso normalmente leva de 1/2 hora (campo de visão (FOV) de 100 x 100 μm) a até 3 horas (1.000 x 500 μm).
      6. Aumente o zoom em pelo menos 100X e escaneie uma pequena área por 10 seg.
         nota: Quando esta área não muda de brilho em comparação com o seu entorno, a pré-irradiação é suficiente.
      7. Traga de volta a abertura de 30 μm (e ganho STEM no meio)
      8. Concentre-se na amostra.
      9. Alinhe a abertura usando o wobbler (com ampliação de ~ 40.000X).
      10. Enquanto estiver focado, selecione a área/recurso mais claro e defina a velocidade de digitalização de forma que os detalhes fiquem visíveis.
      11. No software do microscópio, ajuste o brilho e o contraste observando cuidadosamente o histograma para manter todos os pixels na faixa dinâmica. Faça o mesmo para a área/recursos mais escuros.
      12. Volte para a área clara e verifique novamente. Esteja no lado seguro para que haja algum espaço em ambos os lados do histograma.
      13. Diminua o zoom para que toda a área a ser digitalizada se ajuste à janela de imagem e inicie o programa de aquisição de grandes áreas.
      14. Use a opção do assistente para configurar um mosaico selecionando uma área na tela. Use o tamanho do pixel de 2 a 5 nm, dependendo de quais detalhes são necessários. Use o tempo de permanência de 3 μs para STEM.
      15. Selecione a opção "foco automático no bloco anterior", use o foco automático do software de aquisição em grande escala com as configurações padrão da empresa, marque a caixa "verificar configuração antes da execução" e defina onde salvar os dados.
      16. Pressione "otimizar" para verificar as configurações do microscópio.
          nota: Agora, o tempo necessário será mostrado. Isso pode ser de até 72 horas para áreas de 1 x 0,5 mm.
      17. Na janela, digite "resolução máxima de blocos" 20.000 para que os blocos individuais não sejam maiores que 20k x 20k, evitando efeitos de borda contundente. Pressione "executar".
      18. Quando solicitado para verificar o foco e o brilho/contraste (B/C), desligue o gerador de varredura externo e ajuste cuidadosamente o foco e o astigmatismo no software do microscópio. Não altere B/C.
          nota: A platina pode ser movida e a ampliação alterada, mas a ampliação deve ser ajustada de volta para o tamanho de pixel desejado.
      19. Ligue o gerador de varredura externo novamente e pressione "continuar".

Resultados

Figura 1: Fluxo de trabalho de microscopia eletrônica de tecido em larga escala em cérebros de peixe-zebra. (UMA)Larva de peixe-zebra de 7 dias. (B) Cabeças de larvas de peixe-zebra embutidas lado a lado em resina epóxi. (C) Faca de vidro para seccionar e orientar o espécime semifino. (D) Seção corada de azul de toluidina semifina representativa mos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos
Baixo ponto de fusão de agarose	VWR	Rolamento 444152G
tricaína	sigma	E10521
Tritão- X-100	sigma	100 X
Glutaraldeído	Policiências	1909
Cacodilato de sódio	sigma	C0250
de ósmiotetróxido	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 19114
ferrocianeto de potássio (K4[Fe(CN)]6)	Merck	Nº 4984
etanol	VWR	20821.365
acetato de uranilo	Merck	Nº 8473
de sódiotetraborato	Merck	1063808
Tolduidene azul	Merck	1273
Fucsina Básica	BDH	340324
Citrato de chumbo	BDH	Descontinuado
EPON
anidrido ácido 2-dodecenilsuccínico	Serva	20755
anidrido metilnádico	Serva	Nº 29452
éter glicídico 100	Serva	21045
DMP-30	Policiências	553
Molde de incorporação plano padrão	Ciências da Microscopia Eletrônica	Rolamento 70901
faca de diamante	Diatome Inc.
grades de cobre	Ciências da Microscopia Eletrônica
fita de carbono dupla face	Ciências da Microscopia Eletrônica
Digitalização EM Zeiss Supra55	Zeiss
ultramicrótomo Leica EM UC7	Leica
Gerador de varredura externa Atlas	Oficiais