Diferenciação e Maturação de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Organoides Neurais

Resumo

Fonte: Cosset, E., et al. Organoides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, é demonstrado um protocolo passo a passo para células-tronco embrionárias humanas em organoides neurais. O método envolve a indução da formação de rosetas neuronais, seguida de maturação controlada e cultura final em uma membrana hidrofóbica para obter organoides neurais totalmente desenvolvidos.

Protocolo

1. Manutenção e cultura de células estaminais embrionárias humanas indiferenciadas (hESCs)

1. Realize a manutenção e expansão de hSECs em condições livres de alimentador, pré-revestindo placas com uma matriz extracelular específica.
   1. Descongele 300 μL de matriz extracelular a 4 ° C (concentração típica de 18-22 mg / mL, mantenha no gelo) e misture suavemente com 15 mL de meio DMEM frio (Dulbecco's Modified Eagle Medium) para evitar a gelificação prematura da matriz extracelular. Adicionar 7,5 ml da matriz extracelular a ambos os frascos T150.
   2. Incubar as placas revestidas com matriz extracelular a 37 °C durante pelo menos 1 h (máximo durante a noite).
   3. Remova o meio e semeie hESCs a uma densidade de 6,5 x 104 células/cm².
2. Manter H1 (linha celular hESC) em meio hESC e penicilina / estreptomicina a 1%.
3. Passe as células com o procedimento enzimático: adicione 7,5 ml de solução enzimática a um balão T75 cm2 durante um período de 1-2 min a 37 °C. Quando as células estiverem completamente separadas, adicione 7,5 mL de DMEM-F12 e centrifugue por 5 min a 300 x g. Para permitir uma melhor sobrevivência, recoloque as células na densidade desejada em placas revestidas com matriz extracelular, no mesmo meio contendo inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) (10 μM) por 24 h.

2. Organoides neurais derivados de hESC

1. 24 h antes de iniciar a cultura 3D, substitua o meio hESC por um meio sem soro suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM (ambos os componentes são necessários para apoiar a sobrevivência celular e a formação espontânea de neuroesferas durante a fase de agregação em uma placa de micropoços). As células devem estar em 60% de confluência. No dia seguinte (dia 0), separar as colónias de hESC como células únicas: remover o meio, enxaguar com PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺, adicionar 5 ml de solução de dissolução enzimática e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
2. Colete as células em meio sem soro suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK e centrifugue-as a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e conte as células em 10 mL de meio sem soro suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK.
3. Paralelamente, enxágue a placa de micropoços com 2 mL de meio livre de soro por poço e centrifugue a placa a 1200 x g por 5 min para remover todas as bolhas, o que pode impedir a formação de neuroesferas.
4. Prepare 28,2 x 10⁶ de células em 12,5 mL de meio sem soro suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK. Dispense 1000 células/micropoço. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min e coloque a placa na incubadora a 37 °C durante a noite (máximo 36 h). Por exemplo, para obter 30 organoides neurais humanos, use um frasco T150 a 70% -80% da confluência (cerca de 30 milhões de células).
5. No dia seguinte (dia 1), colete as esferas (com um P1000) e coloque-as em uma placa de 6 poços. Em cada poço, adicione 2 mL de meio B27 e DMEM-F12 GlutaMAX e meio Neurobasal (misture a 1:1), suplementado com 1% de suplementos de B27 e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA). Para promover a indução neural rápida, suplemente o meio com um coquetel de inibição SMAD (Sma e Mad Related Protein) composto por 10 μM de TGFβ (Fator de Crescimento Transformador-beta) / Ativina / Inibidor Nodal e 0,5 μM de inibidor de proteína morfogênica óssea (BMP). A partir deste passo adiante, as esferas são cultivadas em rotação (60 rpm, agitador orbital). A rotação é fundamental para evitar que as esferas grudem umas nas outras ou na placa.
6. Troque o meio a cada 2-3 dias: dobre a placa e deixe as esferas caírem por 5 min, remova metade do meio (2 mL) e adicione 2 mL de meio B27 fresco suplementado com fatores de crescimento e inibidores. Não centrifugue as esferas.
7. Realize a indução neural de acordo com o seguinte curso de tempo:
   1. Dos dias 1-4, cultivar as esferas em meio B27 suplementado com dual-SMAD. O coquetel de inibição de SMAD duplo (10 μM de TGFβ/Activina/inibidor nodal e 0,5 μM de inibidor de BMP) promove a indução neural.
   2. Dos dias 4 a 11, promover a proliferação de rosetas neurais derivadas de hESC (nas esferas), adicionando 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) e 10 ng/mL de fator básico de fibroblastos (bFGF) ao meio B27 suplementado com coquetel duplo-SMAD.
      nota: No dia 11, a maioria das células deve ser positiva para Nestin.
   3. Dos dias 11 a 13, cultivar as esferas em meio B27 suplementado com inibidor de BMP 0,5 μM.
   4. Dos dias 13 a 21, cultivar as esferas em meio B27 suplementado com 10 ng/mL de fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), 10 ng/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1 μM de inibidor da γ-secretase. GDNF e BDNF promovem a diferenciação neuronal e glial. O inibidor da γ-secretase permite maior maturação neural.
   5. No dia 21, coloque as esferas (cerca de 1.000 esferas) em uma membrana hidrofílica de politetrafluoretileno (PTFE) (6 mm de diâmetro, 0,4 μm) depositada em um inserto de placa de cultura projetado para placas de 6 poços. Pare qualquer rotação desta etapa. A presença de rosetas, observada com um microscópio de campo claro, indica o início da diferenciação neural. As rosetas neurais podem ser observadas 2-3 dias após o revestimento das esferas na membrana de PTFE.
   6. Adicione 1 mL de meio B27 suplementado com fatores de crescimento e inibidores (conforme seguido) a cada poço abaixo da inserção da membrana, a cada 2-3 dias (geralmente às segundas, quartas e sextas-feiras), por 3 semanas seguintes de diferenciação.
   7. Dos dias 21 a 25, cultive organoides neurais humanos no mesmo meio de maturação neural.
   8. Dos dias 25 a 28, complemente apenas o meio B27 com 1 μM de inibidor da γ-secretase.
   9. Dos dias 28 a 39, pare de adicionar o inibidor da γ-secretase e continue a cultura de organoides neurais humanos apenas no meio B27.
      nota: Após 3 semanas, os organoides neurais estão prontos para uso no implante do GIC. Ao longo da maturação neural, foi observada uma diminuição do marcador imaturo neural Nestin e aumento dos marcadores neurais maduros β3-tubulina e GFAP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 6 poços (placa de 6 poços)	Falcão / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (placas de cultura de micropoços)	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 34421
Suplementos B27 (B27)	Tecnologias da Vida / Invitrogen	1238	Para ambos os protocolos, solução de estoque 100x, solução final 1x
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)	Orientação celular	GFH1-2	Para ambos os protocolos, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
Composto E, um inibidor da γ-secretase (inibidor da γ-secretase)	Calbioquímica	CAS 209986-17-4	Para ambos os protocolos (inibidor da gama-secretase XXI), solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 1 μM
Dimetilsulfóxido puro (DMSO)	Sigma-Aldrich	C6164	Solvente compostos, pronto para uso
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Tecnologias da Vida	12491-015	Para cultura de células, pronto para uso
Mistura Média Eagle Modificada F-12 de Dulbecco (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Para cultura de células, pronto para uso
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologias da Vida	AM9912	Para cultura de células, pronto para uso
Fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)	Orientação celular	GFH2-2	Para ambos os protocolos, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
Membrana hidrofílica de politetrafluoretileno (membrana de PTFE)	Interface BioCell	Descontinuado
LDN-193189 (inibidor de BMP)	Axônio Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)	Gibco	25030081	L-Glutamina (200 mM), solução de reserva 200 mM, solução final 2 mM
Matrigel (matriz extracelular)	BD Biociências	354277	Matriz qualificada para hESC, solução estoque 18-22 mg / mL, solução final 180-220 μg / mL
Inserto de placa de cultura Millicell-CM (0,4 μm) (inserto de placa de cultura)	Millipore	PICM03050
Anticorpo monoclonal anti-β-tubulina III	sigma	T8660	Diluição de 1/1000
Agitador Orbital MS, MS-NOR-30 (Agitador Orbital)	Ciência Principal	MS-NRC-30
Neurobasal (Neurobasal)	Tecnologias de Vida / Gibco	21103049	Manutenção e maturação de populações de células neuronais embrionárias, prontas para uso
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Gibco	11140	Aminoácidos não essenciais 100X, solução estoque 100x, solução final 1x
Anticorpo Nurr1 (M-196)	Santa Cruz	SC-5568	Diluição de 1/100
Nutristem (meio hESC)	Indústrias Biológicas	05-100-1A	Meios de células-tronco, prontos para uso
Penicilina / Estreptomicina (Penicilina / Estreptomicina)	Tecnologias de Vida / Gibco	15140122	Para cultura de células, solução de reserva 5 mg/ml, solução final 50 μg/ml
Solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+/Mg2+ (PBS sem Ca2+/Mg2+)	Tecnologias da Vida	14190250	Para cultura de células, pronto para uso
Quinase associada a Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Bioquímicos	AB120129-1	Inibidor de rocha, solução estoque 50 mM em DMSO, solução final 10 μM
SB-431542 (TGFβ / Ativina / Inibidor nodal	subida	Asc- 163	Dual-Smad, solução de estoque 50 mM em DMSO, solução final de 10 μM
StemPro Accutase (solução enzimática hESC)	Gibco	A11105-01	Solução enzimática hESC, pronta a usar
Balão T150 (balão T150)	falcão	08-772-1F
Fatores de Crescimento Transformadores beta 3 (TGFβ3)	Orientação celular	GFH109-2	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μg/mL em etanol puro, solução final 1 ng/mL
Tripsina 0,25% (solução enzimática)	Tecnologias da Vida	15050065	Solução enzimática, pronta a usar
X-vivo (meio livre de soro)	Lonza	BE04-743Q	meio livre de soro, pronto para você