Geração de Organoides Neuronais Dopaminérgicos a partir de Células-Tronco Embrionárias Humanas

Resumo

Fonte: Cosset, E. et al. Organoides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em neurônios dopaminérgicos, para fornecer um modelo para estudar a doença de Parkinson. As hESCs são cultivadas em um meio de indução neural em uma placa de micropoços para formar neuroesferas 3D. Estes são então cultivados em um meio de indução neural para promover a diferenciação em neurônios progenitores dopaminérgicos. A maturação final dos neurônios ocorre em uma inserção de cultura sob condições de interface ar-líquido, resultando em organoides 3D consistindo de neurônios dopaminérgicos maduros.

Protocolo

1. Organoides dopaminérgicos derivados de hESC para estudos de doença de Parkinson (DP)

1. Dia 0: Amplificar hESCs em cultura 2D até 60% de confluência (dia 0) e, em seguida, substituir o meio de células-tronco usado para manter as características de pluripotência das hESCs por um meio sem soro. Inicie a indução neural suplementando o meio de cultura com 0,5 μM de inibidor da proteína morfogenética óssea (BMP) e 10 μM de inibidor do fator de crescimento transformador beta (TGFβ)/Activina/Nodal (coquetel de inibição dupla de SMAD) e, em seguida, adicione 10 μM de inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) por 24 h para aumentar a taxa de sobrevivência das células durante a passagem.
2. Dia 1: Prepare a placa de micropoços com 2,5 mL por poço de meio livre de soro suplementado com inibidor de BMP de 0,5 μM, inibidor de TGFβ/Activina/Nodal de 10 μM e inibidor de ROCK de 10 μM. Para especificar as células em direção ao padrão ventral do tubo neural, adicione 100 ng/mL de ouriço sônico (SHH), fator de crescimento de fibroblastos 8 de 100 ng/mL (FGF8) e agonista suavizado de 2 μM. Centrifugue a placa (apenas com meio e sem células) a 1200 x g por 5 min para remover as bolhas de ar dos micropoços.
   1. Após 1 dia de indução neural em 2D, remova o meio e lave rapidamente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca²⁺/MgCl²⁺. Dissociar as colónias em suspensão monocelular, adicionando 7,5 ml de solução enzimática recombinante num balão T75 cm². Incube por 2 min a 37 ° C e complete com 7,5 mL da mistura de meio / nutriente Eagle modificada de Dulbecco F-12 (DMEM-F12).
   2. Recolher a suspensão celular e centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retirar o sobrenadante e contar as células no mesmo meio utilizado para preparar a placa de micropoços.
   3. Ajuste o volume do meio para obter uma suspensão celular que permita formar neuroesferas contendo 1000 células por micropoço (por exemplo, a placa de micropoços usada aqui contém 4.700 micropoços por poço). Então, prepare 4,7 milhões de células em 2,5 mL de meio e adicione aos 2,5 mL anteriores de meio já colocados na placa.
   4. Para distribuir corretamente as células em cada micropoço, agite suavemente a placa e centrifugue a placa de micropoços 300 x g por 5 min. Incube a placa a 37 ° C por 24 h para gerar esferas.
3. Dia 2: Lave suavemente os micropoços com o meio e colete, em seguida, transfira as esferas em uma placa de seis poços tratada com tecido. Substitua o meio por meio neurobasal suplementado com 1% de B27, 1x aminoácidos não essenciais (NEAA), 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina. Além disso, adicione fatores de regionalização SHH, FGF8, agonista suavizado e pequenas moléculas de inibição de SMAD duplo.
   1. Colocar as esferas em rotação a 37 °C (60 rpm, agitador orbital) e mudar meio meio suplementado de 2 a 3 dias.
4. Dia 3: Para melhorar a indução neural e converter em progenitores neurais com uma identidade no mesencéfalo, suplemente o meio com 3 μM de inibidor de glicogênio sintase quinase-3 beta (GSK-3β), que ativa a via Wnt / β-catenina. Mantenha o inibidor de GSK-3β no meio até o dia 13. Dividido em duas novas placas de 6 poços tratadas com tecido para reduzir a densidade da esfera por poço e evitar a agregação da esfera.
   nota: No dia 8, a maioria das células deve ser positiva para Nestin.
5. Dia 8: Inicie a maturação neural: substitua os fatores de regionalização SHH, FGF8, agonista suavizado e coquetel de inibição de SMAD duplo por 0,5 mM de monofosfato de adenosina cíclico dibutiril (cAMP) (para favorecer a maturação), inibidor de histona desacetilase 20 nM (para saída do ciclo celular), inibidor de γ-secretase 1 μM e fatores de crescimento, fator neurotrófico derivado de linhagem glial de 10 ng/mL (GDNF), Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) de 10 ng/mL, fator de crescimento transformador β3 de 1 ng/mL (TGFβ3) e fator de crescimento de fibroblastos 20 de 5 ng/mL (FGF20) (ambos favorecem a sobrevida do progenitor dopaminérgico [DA]). Troque o meio a cada 2-3 dias.
6. Dia 21: Gerar o organoide neural: semear cerca de 100 neuroesferas em condições de interface ar-líquido em politetrafluoretileno (membrana de PTFE, 6 mm de diâmetro). Transfira a membrana para uma inserção de placa de cultura (0,4 mm) e adicione 1,2 mL de meio de maturação neural usado para diferenciação da neuroesfera, conforme descrito anteriormente.
   1. Pare qualquer rotação desta etapa. Troque o meio a cada 2-3 dias até que o ponto de tempo de diferenciação necessário seja alcançado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de 6 poços (placa de 6 poços)	Falcão / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (placas de cultura de micropoços)	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 34421
Suplementos B27 (B27)	Tecnologias da Vida / Invitrogen	1238	Para ambos os protocolos, solução de estoque 100x, solução final 1x
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)	Orientação celular	GFH1-2	Para ambos os protocolos, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
CHIR-99021 (inibidor de GSK-3β)	Axônio Medchem	CT99021	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 7,5 mM em DMSO, solução final 3 μM
Composto E, um inibidor da γ-secretase (inibidor da γ-secretase)	Calbioquímica	CAS 209986-17-4	Para ambos os protocolos (inibidor da gama-secretase XXI), solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 1 μM
Dibutiril cíclico-AMP (Dibutiril cAMP)	sigma	D0627	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 0,5 M em DMSO, solução final 0,5 mM
Mistura Média Eagle Modificada F-12 de Dulbecco (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Para cultura de células, pronto para uso
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologias da Vida	AM9912	Para cultura de células, pronto para uso
Fator de Crescimento de Fibroblastos 20 (FGF20)	Peprotech	100-41	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 5 ng/mL
fator de crescimento de fibroblastos 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 100 ng/mL
Fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)	Orientação celular	GFH2-2	Para ambos os protocolos, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 20 ng/mL
Membrana hidrofílica de politetrafluoretileno (membrana de PTFE)	Interface BioCell	Descontinuado
LDN-193189 (inibidor de BMP)	Axônio Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, solução estoque 5 mM em DMSO, solução final 0,5 μM
L-glutamina (L-glutamina)	Gibco	25030081	L-Glutamina (200 mM), solução de reserva 200 mM, solução final 2 mM
Inserto de placa de cultura Millicell-CM (0,4 μm) (inserto de placa de cultura)	Millipore	PICM03050
Agitador Orbital MS, MS-NOR-30 (Agitador Orbital)	Ciência Principal	MS-NRC-30
Suplementos de N2 (N2)	Invitrogen	17502-048	Para cultura GIC, solução de estoque 100x, solução final 1x
Neurobasal (Neurobasal)	Tecnologias de Vida / Gibco	21103049	Manutenção e maturação de populações de células neuronais embrionárias, prontas para uso
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Gibco	11140	Aminoácidos não essenciais 100X, solução estoque 100x, solução final 1x
Nutristem (meio hESC)	Indústrias Biológicas	05-100-1A	Meios de células-tronco, prontos para uso
Penicilina / Estreptomicina (Penicilina / Estreptomicina)	Tecnologias de Vida / Gibco	15140122	Para cultura de células, solução de reserva 5 mg/ml, solução final 50 μg/ml
Solução salina tamponada com fosfato sem Ca2+/Mg2+ (PBS sem Ca2+/Mg2+)	Tecnologias da Vida	14190250	Para cultura de células, pronto para uso
Purmorfame (agonista suavizado)	Calbioquímica	SML0868	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 10 mM em DMSO, solução final 2 μM
Quinase associada a Rho Y-27632 (ROCK)	Abcam Bioquímicos	AB120129-1	Inibidor de rocha, solução estoque 50 mM em DMSO, solução final 10 μM
SB-431542 (TGFβ / Ativina / Inibidor nodal	subida	Asc- 163	Dual-Smad, solução de estoque 50 mM em DMSO, solução final de 10 μM
Ouriço Sônico (SHH)	Orientação celular	GFH168-5	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μg/mL em H2O puro, solução final 100 ng/mL
StemPro Accutase (solução enzimática hESC)	Gibco	A11105-01	Solução enzimática hESC, pronta a usar
Balão T150 (balão T150)	falcão	08-772-1F
Fatores de Crescimento Transformadores beta 3 (TGFβ3)	Orientação celular	GFH109-2	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μg/mL em etanol puro, solução final 1 ng/mL
Trichostatina A (inibidor da histona desacetilase )	sigma	T8552	Para protocolo dopaminérgico, solução estoque 100 μM em DMSO, solução final 20 nM
TrypLE (solução enzimática recombinante)	Invitrogen	12604021	Solução enzimática recombinante, pronta a usar
Tripsina 0,25% (solução enzimática)	Tecnologias da Vida	15050065	Solução enzimática, pronta a usar
X-vivo (meio livre de soro)	Lonza	BE04-743Q	meio livre de soro, pronto para uso

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