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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Estabelecimento de infarto na ponte
- Pré-aqueça a almofada de aquecimento imediatamente antes da anestesia.
- Prenda a broca de crânio ao suporte na estrutura estereotáxica.
- Injete intraperitonealmente nos ratos 50 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. Verifique a falta de resposta de beliscões do dedo do pé.
- Monte o rato na estrutura estereotáxica na posição de bruços. Posicione as barras auriculares acima do canal auditivo para prender a cabeça. Certifique-se de que o crânio seja mantido na horizontal para evitar qualquer distorção da injeção.
- Mantenha a anestesia com isoflurano (100% de oxigênio, 2,5% de isoflurano) por meio de um acessório de cone nasal estereotáxico para ratos com portas de entrada e saída. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura em 37 °C e monitore-a durante todo o procedimento.
- Use pomada para os olhos para evitar o ressecamento da córnea. Use uma pinça para beliscar as patas para garantir que não haja uma resposta à dor levemente.
- Raspe o cabelo do crânio com um micro-barbeador. Aplique circularmente o esfoliante cirúrgico com clorexidina, começando no local da incisão cirúrgica e girando para fora.
- Faça uma incisão na linha média de 3 cm com um bisturi da linha do canto lateral bilateral até 0,5 cm atrás da fontanela posterior, que um marcador cirúrgico deve marcar.
- Use um cotonete para remover o sangue.
- Um pedaço de fita cirúrgica deve ser colocado em cada lado do retalho cutâneo para exposição do couro cabeludo (Figura 1).
- Remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio com um cotonete embebido em NaCl a 0,9%. Se não forem removidos, os tecidos conjuntivos ficarão presos na broca.
- Identifique o bregma. Escolha o ponto central do bregma como ponto de origem e marque-o com um marcador cirúrgico preto de ponta fina.
- Coloque uma broca a 6.0 mm AP, 2.0 mm ML (faixa de 0.5 a 3.0 mm, Figura 2A).
- Realize craniotomia (1 mm de diâmetro) usando uma broca automática. Proceda com cuidado porque este ponto está próximo ao seio venoso.
- Remova a broca da estrutura estereotáxica.
- Coloque uma sonda de 22 G com uma bainha isolada na estrutura estereotáxica (Figura 3A). A ponta da sonda deve ser colocada 2 mm acima da extremidade proximal da bainha (Figura 3A, B; Figura 2B).
- Certifique-se de que a bainha entra no cérebro 7 mm (7 mm DV, Figura 2B; Figura 1C).
- Avance a sonda ao longo da bainha (Figura 1D) até que a ponta da sonda esteja 9 mm abaixo da superfície do cérebro (Figura 2D).
- Conecte os eletrodos a um estimulador elétrico (Figura 3C). Conecte o ânodo à sonda conforme mostrado na Figura 1D. Conecte o cátodo aos ratos (geralmente ao ouvido dos ratos).
- Ligue o estimulador elétrico e configure os seguintes parâmetros: largura de pulso simples = 4.050 ms; tensão = 50 V; e corrente = 4 mA (Figura 3C). Durante a estimulação elétrica, o rato exibirá tremores. Neste estudo, o dispositivo não foi ligado para ratos do grupo controle usados para os testes comportamentais, ressonância magnética e TTC.
- Deixe a sonda na posição por 5 minutos após a estimulação.
- Remova a sonda do cérebro (Figura 1F).
- Use cimento ósseo para cobrir a craniotomia. Deixe o cimento secar antes da sutura da ferida.
- Suturar a ferida com filamentos de sutura de poliamida 4-0. Depois de três ou quatro pontos, amarre os nós cirúrgicos padrão 2-1-1.
- Injete nos ratos penicilina (0,25 mL, 80 UI diluídos em 4 mL de solução salina) por via intraperitoneal para prevenir a infecção.
- Injetar meloxicam nos ratos por via subcutânea na dose de 2 mg/kg e repetir de 24 em 24 horas.
- Monitore os ratos a cada 15 minutos até que estejam totalmente acordados e devolva-os à gaiola com uma almofada de aquecimento. Fornecer livre acesso a comida e água até o sacrifício.
nota: Todos os procedimentos devem seguir os princípios cirúrgicos assépticos. Antes da cirurgia, coloque uma blusa, máscara cirúrgica e luvas estéreis após uma esfregada cirúrgica das mãos. Sempre mantenha o material de sutura estéril dentro do campo estéril.
