Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Cateterismo arterial
- Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina e um analgésico de acordo com a prática local (por exemplo, buprenorfina). Aperte os membros posteriores com uma pinça para confirmar a profundidade correta da anestesia.
nota: Para este estudo, foram utilizados camundongos C57BL / 6N machos com 8 a 12 semanas de idade (peso de 20 a 25 g). Os autores testaram BALB/c machos da mesma idade sem sucesso, mas não tentaram outras cepas.
- Remova os pelos nas regiões de interesse (cabeça, pescoço) usando um barbeador elétrico. Certifique-se de que nenhum cabelo solto permaneça para evitar a contaminação da ferida. Em seguida, desinfetar o campo cirúrgico com etanol/clorexidina/betadina a 70% e colocar o camundongo em decúbito dorsal com a cabeça voltada para o cirurgião.
- Faça uma incisão na linha média cervical com uma tesoura de dissecação.
- Disseque as glândulas submandibulares e o tecido muscular do pescoço e separe-os para expor a artéria carótida comum. Use principalmente dissecção romba por meio de fórceps.
- Lugar três 8-0 ligaduras de seda abaixo da artéria carótida comum direita.
- Coloque uma pinça na ligadura proximal e traga tensão para a artéria para que o fluxo seja suspenso.
- Feche a ligadura mais distal.
- Insira o cateter arterial através de um pequeno orifício de pele pré-formado no aspecto cranial da incisão. Aperte e deforme o lúmen do cateter se parecer muito grande para reduzir o refluxo sanguíneo. Fixe com todas as três ligaduras.
- Fixe o cateter na pele para evitar luxação. Faça isso usando uma sutura (por exemplo, monofilamento 5-0, não absorvível) que conecta o cateter à pele na área do orifício da pele pré-formada.
2. Traqueostomia
- Disseque a musculatura pré-traqueal sem rodeios usando uma pinça.
- Coloque dois 8-0 ligaduras de seda abaixo da traqueia.
- Traqueotomizar com microtesoura o mais proximalmente possível para evitar ventilação unilateral. Use uma linha de corte horizontal entre duas cartilagens traqueais.
- Insira o tubo de ventilação e fixe com as duas ligaduras preparadas.
nota: A extremidade proximal da traqueia não precisa ser ligada.
- Feche a pele com uma sutura contínua (por exemplo, monofilamento 6-0, não absorvível).
- Ventile o mouse com uma frequência de 150/min e um volume corrente de 200 μL.
3. Indução de morte encefálica (TB)
- Organize o mouse na posição de bruços.
- Remova a pele do crânio usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça para segurar a pele.
- Perfure um furo de calibre 1 mm paramedialmente acima do córtex parietal esquerdo. Pare de perfurar antes de romper o osso compacto interno e a dura-máter.
- Penetre na ponte de tecido final do crânio usando uma pinça romba, removendo as bordas afiadas.
- Insira o cateter balão, de modo que fique inteiramente dentro da cavidade craniana. Certifique-se de que o balão esteja pré-cheio com solução salina e que todo o ar seja evacuado.
- Comece a inflar a ~0,1 mL/min durante um período de 10−15 min (volume total de 0,8−1,2 mL) com a ajuda de uma bomba de seringa.
nota: O camundongo exibirá mioclonia, midríase, atividade convulsiva adicional e suspiros agonais.
- Declare o cérebro do rato morto assim que a cauda do rato ficar rígida e ereta.
nota: A DB é confirmada por um pico de pressão arterial inicial característico (reflexo de Cushing), ausência de reflexos do tronco encefálico e respiração espontânea. Testes regulares de apneia devem ser evitados durante os experimentos, pois os camundongos podem se tornar instáveis circulatórios devido à falta de oxigênio.
- Pare a inflação do cateter de balão.
- Coloque um cobertor de aquecimento sobre o mouse para evitar hipotermia.
