NOTA: As linhagens transgênicas usadas neste estudo incluem linhagem específica de macrófagos mpeg1:mCherry (construída internamente), mpo específica de neutrófilos: GFP, gata1:dsRed específica para eritróides e ubiq:secAnnexinV-mVenus, um repórter de morte celular (re-derivada internamente) em fundos de tipo selvagem, nácar (mitfaw2/w2) e mutante (bbhm292).
1. Dia 0: Produção e coleta de ovos
- Coletar embriões fertilizados da desova natural em criadouros produzidos a partir de 1 zebrafish adulto macho e 1-2 fêmeas.
nota: Para o protocolo de atorvastatina, qualquer animal selvagem/transgênico pode ser usado; no entanto, as taxas de hemorragia diferem ligeiramente entre as cepas.
- Incubar 100 embriões a 28 °C em meio embrionário E3 padrão por placa de Petri e estágio de acordo com as diretrizes padrão.
- Em ~ 6 horas após a fertilização (hpf), remova os embriões mortos e não fertilizados do prato usando uma pipeta Pasteur. A Figura 1 mostra a linha do tempo experimental.
2. Dia 1: Tratamento com atorvastatina a 24 hpf
- Embriões de descorionato para tratamento com atorvastatina usando pinças de dissecção afiadas e ultrafinas. Os números necessários para a experimentação podem ser ajustados de acordo.
- Adicione 30 mL de meio embrionário E3 a duas placas de Petri limpas. Use um prato para 100 embriões.
nota: Se as placas forem projetadas para cultura de células, o peixe-zebra descorionado neste estágio inicial geralmente gruda no fundo. Para evitar isso, enxágue bem as placas em água limpa antes de usar.
- Remova 60 μL de água embrionária da placa de tratamento e adicione 60 μL de atorvastatina 0,5 mM (ATV). A uma concentração de estoque de 0,5 mM, a diluição acima resultará em uma concentração final de 1 μM, resultando em ~ 20% de larvas sem hemorragia (ICH-) e ~ 80% de larvas hemorragiadas (ICH+). Use a outra placa para controles não tratados.
nota: A atorvastatina é solubilizada em água destilada (3 mg em 10 mL) para fazer uma solução estoque de 0,5 mM. Incubar durante a noite à temperatura ambiente no escuro com agitação, pois a solubilização leva algum tempo. A solubilização completa pode levar até 1 semana. Não use DMSO (dimetilsulfóxido). A solução é aliquotada e armazenada a -20 ° C. Não congele e descongele.
- Usando uma pipeta Pasteur, transfira 100 embriões com o mínimo de água possível para as placas de tratamento.
- Incubar as placas a 28 °C.
nota: HIC (hemorragia intracerebral) ocorrerá entre 33 e 48 hpf. A atorvastatina não precisa ser removida, pois a incubação por mais de 24 horas não causa mais problemas de desenvolvimento.
3. Dia 2: Separando as populações ICH- e ICH+ a 50 hpf
- Separe os peixes ICH+ das populações de ICH- e transfira para novos pratos para facilitar.
- Se usar o modelo ATV em uma concentração de 1 μM, 75-100% das larvas exibirão hemorragia (ICH+) neste momento.
nota: A resposta das larvas difere entre as cepas, se as larvas não estiverem hemorragiando nas frequências desejadas, use um novo lote de atorvastatina ou uma concentração mais alta. Se as larvas não exibiram hemorragia em 48 hpf, considere-as ICH-.
- Se usar o modelo bbh, todos os mutantes homozigotos exibirão hemorragia em 48 hpf. Se estiver usando um cruzamento heterozigoto, os irmãos heterozigotos e selvagens podem ser usados como animais de controle para experimentos.
- Se necessário, anestesiar as larvas adicionando 0,02% de MS222 ao meio E3. Usando uma pipeta Pasteur, separe as larvas quanto à presença de sangue na cabeça em meio E3 fresco. Veja a Figura 2.
nota: O sangue na cabeça pode aparecer no prosencéfalo, no meio ou no rombencéfalo ou em combinação, e o volume do sangramento pode variar entre os animais. Nos mutantes bbh, a HIC é frequentemente associada a edema grave, que é reconhecível por cabeças maiores, maior espaço entre os olhos e sangramento mais difuso. No entanto, nem todas as larvas de BBH ICH+ apresentam edema.
