Coloração Imunofluorescente de Sialoglicoproteínas em Células Progenitoras Neurais e Neurônios

Resumo

Fonte: Bai, Q., et al., Identificando marcadores de superfície celular de células-tronco neurais primárias e células progenitoras por marcação metabólica de sialoglicano. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a biotinilação e marcação fluorescente de sialoglicoproteínas modificadas em células-tronco neurais primárias e progenitoras, bem como neurônios, e sua visualização usando microscopia de fluorescência.

Protocolo

1. Coloração Imunofluorescente de Sialoglicoproteínas em NSPCs Primárias Expandidas e Neurônios Diferenciados

1. Prepare o complexo BTTAA-CuSO₄ 1 30x contendo 1.5 mM CuSO₄ e 9 mM BTTAA em água bidestilada Prepare o tampão 1 recém-conjugado com biotina contendo 50 μM de biotina-alcino, 2,5 mM de ascorbato de sódio e 1x complexo BTTAA-CuSO₄ em PBS.
2. Remova as inserções das placas de co-cultura. Aspire o meio de cultura dos poços inferiores e lave as células neurais uma vez com PBS pré-aquecido.
3. Aspire o PBS dos poços. Adicione 1 mL de solução pré-resfriada de PBS de paraformaldeído a 4% por poço às células e fixe-as em RT por 10 min. Em seguida, lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado.
4. Aspire PBS dos poços e adicione 1 mL de tampão conjugado com biotina recém-preparado 1 por poço nas células. Incubar as células em RT durante 10 min.
5. Aspirar o tampão de reação dos poços. Lave as células 3 vezes com PBS. Prepare o tampão de coloração contendo 1% de FBS e 1 μg / mL de Alexa Fluor 647-estreptavidina. Adicione 1 mL de tampão de coloração por poço nas células e incube as células em RT por 30 min.
6. Aspire o tampão de coloração dos poços e lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado. Prepare o tampão de bloqueio contendo 5% de BSA e 0,3% de detergente não iônico-100 em PBS. Adicione 1 mL de tampão de bloqueio por poço nas células e incube em RT por 10 min.
7. Prepare uma solução de anticorpo primário diluindo os anticorpos anti-nestina e anti-β-tubulina III juntos no tampão de bloqueio nas proporções de 1:20 e 1:1.000, respectivamente. Remova o tampão de bloqueio dos poços e adicione 1 mL de solução de anticorpo primário por poço nas células. Incubar as células a 4 °C durante a noite.
8. Remova a solução de anticorpos primários dos poços. Lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado. Prepare uma solução de anticorpo secundário diluindo Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG1, Alexa Fluor 546 cabra anti-camundongo IgG2b e DAPI juntos em tampão de bloqueio em uma diluição de 1:1.000. Aspire o PBS dos poços e adicione 1 mL de solução de anticorpo secundário por poço nas células. Incubar as células em RT durante 2 h.
9. Aspire a solução de anticorpos dos poços e lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado. Depois, as células estão prontas para a captura da imagem.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro fetal bovino	Gibco	10099141	10% de sucesso
Paraformaldeído	sigma	158127	4% de sucesso
DAPI	Gibco	Nº 62248
Placa de 6 poços	Corning	3335
Camundongo monoclonal anti-Nestin	Estudo de Desenvolvimento Banco de Hibridoma	Rato-401	1 a 20
Anti-beta-tubulina III monoclonal de camundongo	sigma	T8860	1 a 1000
Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG1	Invitrogen	A-21121	1 a 1000
Alexa Fluor 546 cabra anti-rato IgG2b	Invitrogen	A-21143	1 a 1000
Tritão X-100	Amresco	Episódio 694
Sulfato de cobre	sigma	209198
Alcino-biotina	Clique em Ferramentas de Química	TA105
BTTAA	Clique em Ferramentas de Química	1236
ascorbato de sódio	sigma	Rolamento A4034
Alexa Flour 647-conjugado estreptavidina	Invitrogen	S21374	1 a 1000