Avaliação in vitro de β amilóide agregado no colapso do cone de crescimento neuronal

Resumo

Fonte: Kuboyama, T. Visualizando o colapso do cone de crescimento axonal e os efeitos iniciais do β amilóide em neurônios de camundongos cultivados. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra uma avaliação in vitro do colapso do cone de crescimento neuronal por agregados de β amilóide (Aβ). O tratamento dos neurônios com agregados Aβ causa desestabilização do citoesqueleto, levando ao colapso dos cones de crescimento na ponta dos axônios. As células tratadas são comparadas com as células de controle para avaliar a extensão do colapso do cone de crescimento.

Protocolo

1. Ensaio de colapso

1. Poli-D-lisina coating
   1. Cubra as lâminas de cultura de 8 poços com 400 μL de poli-D-lisina (PDL) de 5 μg / mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incube-as a 37 ° C durante a noite.
   2. Remova a solução PDL e lave os poços 3 vezes com água destilada.
2. Cultura de neurônios
   1. Pique córtices cerebrais recém-isolados de camundongos embrionários do dia 14 (E14) ddY (Deutschland, Denken e Yoken) com microtesoura em meio de cultura de neurônios contendo 12% de soro de cavalo, 0,6% de glicose e 2 mM de L-glutamina (meio A). Não adicione antibióticos.
      nota: Neste protocolo, o mouse ddY é usado. Esta é uma linhagem não consanguínea comumente usada no Japão. Este protocolo de cultura de neurônios também pode ser aplicado para neurônios corticais de ratos.
   2. Centrifugue os tecidos a 87 x g por 3 min.
   3. Remova o sobrenadante. Em seguida, ao pellet, adicione 2 mL de tripsina a 0,05% e incube por 15 min a 37 ° C. Misture batendo a cada 5 min.
   4. Adicione 4 mL de meio A e misture batendo.
   5. Centrifugue os tecidos a 178 x g por 3 min.
   6. Remova o sobrenadante e incube os tecidos com 600 U / mL de desoxirribonuclease I (DNase I) e 0,3 mg / mL de inibidor de tripsina de soja dissolvido em PBS por 15 min a 37 ° C. Misture batendo a cada 5 min.
   7. Após a incubação, adicione 4 mL de meio A e misture batendo.
   8. Centrifugue os tecidos a 178 x g por 3 min.
   9. Após a remoção do sobrenadante, adicione 4 mL de meio A e triture os tecidos com uma pipeta Pasteur polida.
   10. Filtrar os tecidos triturados com uma malha de poros de 70 μm. Após a filtração, calcule a densidade das células com um hemocitômetro.
   11. Cultivar as células na lâmina de cultura de 8 poços a 0,8 x 10⁴ células/poço com meio A e mantê-las numa incubadora de CO₂ com uma atmosfera humidificada de 10% de CO₂ a 37 °C.
   12. Após 4 h de cultivo, substitua o meio de cultura por um contendo 2% de suplemento para cultura neuronal, 0,6% de glicose e 2 mM de L-Glutamina (meio B).
       nota: A pureza dos neurônios era de aproximadamente 75%, conforme descrito anteriormente.
3. Ensaio de colapso
   1. Dissolver o β1-42 amiloide de comprimento total obtido comercialmente (Aβ1-42) em água destilada a uma concentração de 0,5 mM e incubar a 37 °C durante 7 dias. Após a incubação, armazenar a solução agregada de Aβ1-42 em um freezer a -30 °C até o uso.
      nota: Esta incubação é necessária para a agregação e toxicidade de Aβ.
   2. Após 4 dias de cultura neuronal, tratar os poços com 100 μL de novo meio B, contendo 0,5 μM agregado de Aβ1-42 ou solução veículo (água destilada) por 1 h.
      nota: Os efeitos de Aβ1-42 foram aumentados de 0,1 para 5 μM de forma dependente da dose e atingiram o pico de 0,5 μM, conforme descrito anteriormente. Resultados semelhantes podem ser observados quando pelo tratamento com Aβ1-42 por 1 h após 3 dias de cultura neuronal.
   3. Retirar o meio de cultura e fixar imediatamente os neurónios com paraformaldeído a 4% contendo 4% de sacarose em PBS durante 1 h a 37 °C numa placa quente.
   4. Após a fixação, lave os neurônios 3 vezes com PBS e monte-os com um meio de montagem aquoso. Seque o meio de montagem a 4 °C por 2–4 dias.
   5. Capture toda a área (7,8 x 9 mm²) de cada poço com uma lente objetiva seca de 20X em um microscópio invertido.
   6. Classifique os neuritos mais longos de cada neurônio no estágio 3 ou 4 como axônios, conforme descrito anteriormente.
   7. Classifique os cones de crescimento de acordo com os seguintes critérios: 1) cones de crescimento axonal sem lamelipódios ou 2) possuindo menos de três filopódios são considerados cones de crescimento colapsados, conforme descrito anteriormente.
      nota: Os cones de crescimento saudável são pontuados como 0 ponto; Os cones de crescimento colapsados são pontuados como 1 ponto. Os escores médios de colapso são calculados para cada tratamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ratos ddY	Slc
Lâmina de cultura de oito poços	falcão	354108
lisina poli D	Wako	168-19041
Meio de cultura, meio neurobasal	Gibco	Rolamento 21103-049
soro da casa	Gibco	Rolamento 26050-088
glicose	Wako	Telefone: 049-31165
L-glutamina	Wako	Telefone: 074-00522
0,05% de tripsina	Gibco	Rolamento 25300-054
DNase I	Worthington	Dp
inibidor de tripsina de soja	Gibco	17075-029
Filtro com tamanho de malha de 70 μm, filtro de células	falcão	Rolamento 352350
Suplemento B-27	Gibco	Rolamento 17504-044
Incubadora de CO2	Astec	SCA-165DS
β1-42 amilóide	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldeído	Wako	Rolamento 162-16065
sacarose	Wako	196-00015
Meio de montagem aquoso, AquaPoly/Mount	Policiências	18606-20
Microscópio invertido A	Carl Zeiss	Observador Axio Z1	Conectado com AxioCam MRm, Unidade de Aquecimento XL S, Módulo de CO2 S1 e TempModule S1
Plano Objetivo-Apocromático 20x	Carl Zeiss	Rolamento 420650-9901