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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de Cortes de Tecido para Espectrometria de Massa por Imagem (IMS)
- Processamento de amostra de tecido de um cérebro humano autopsiado
nota: Certifique-se de que a etapa de preparação da amostra para IMS preserve o estado original do tecido. Evite contaminação e alterações post-mortem. O passo seguinte é crucial.
- Obtenha amostras corticais humanas para IMS de cérebros que foram removidos, processados e armazenados a -80 ° C dentro de 8 h post-mortem. Pegue a amostra do cérebro do córtex occipital de pacientes com doença de Alzheimer (DA) e controles pareados por idade.
- Preparação de secções de tecido congeladas
- Corte as seções de tecido em um criostato. Coloque lâminas de vidro de microscópio revestidas com óxido de índio-estanho condutor (ITO) dentro do criostato.
- Aquecer a amostra cerebral da autópsia de -80 °C a -22 °C no interior do criostato.
- Anexe uma nova lâmina descartável ao criostato para cada experimento. Sempre tente usar uma parte limpa da lâmina.
- Coloque os cérebros de autópsia congelados no palco junto com uma pequena quantidade de composto de temperatura de corte ideal (OCT) (o suficiente para cobrir a área central do palco; consulte a Tabela de Materiais).
- Escolha as condições para o corte fino. Para IMS, use uma espessura de 10 a 12 μm para seções do cérebro humano. Para IMS e imuno-histoquímica (IHQ), corte de cinco a seis seções de cada amostra de tecido.
- Quando a lâmina estiver começando a cortar o tecido, gire a roda e "enfrente" o bloco até que todo o tecido esteja exposto. Se houver uma pequena faixa ou rasgo na seção, espere um pouco mais no criostato até que o ajuste de temperatura o corrija automaticamente. Conte alguns segundos antes de abrir o anti-rolo com um lenço de papel por baixo.
- Coloque imediatamente a fatia de tecido no lado revestido com ITO da lâmina de vidro. Descongele a fatia de tecido colocando um dedo por baixo da lâmina no lado não revestido com ITO. O tecido grudará na lâmina; Certifique-se de que o tecido seja o mais plano possível, sem rugas. Execute esta etapa em temperatura ambiente.
nota: Use luvas, máscaras e um avental de laboratório, pois as amostras humanas podem conter contaminantes biológicos. Quando todas as seções tiverem sido feitas para o dia, limpe o criostato, escovas e mandris com lenços de laboratório e 200 mL de etanol 100%.
- Enxaguar as secções de tecido
- Mergulhe as amostras em 40-100 mL de etanol a 70% por 30 s para remover lipídios endógenos e sais inorgânicos. Use um frasco de mancha de vidro.
- Lave as amostras com 40 a 100 mL de etanol a 100% por 30 s, 40 a 100 mL de solução de Carnoy por 3 min, 40 a 100 mL de etanol a 100% por 30 s, 40 a 100 mL de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% por 1 min e 40 a 100 mL de etanol a 100% por 30 s. Use um frasco de coloração de vidro.
nota: A solução de Carnoy é um fixador composto por seis partes de etanol, três partes de ácido acético e uma parte de clorofórmio.
- Seque no vácuo por 30 min.
- Tratamento das seções de tecido com vapor de ácido fórmico para uma melhor ionização das proteínas Aβ dos tecidos cerebrais da autópsia
- Prepare o forno e a lâmina de vidro de incubação a serem usados para a vaporização subsequente com 5 mL de ácido fórmico 100%. Para obter um tratamento ácido satisfatório, mantenha a umidade do ar na placa de vidro de incubação no nível de saturação durante toda esta etapa e mantenha a temperatura em 60 ° C. Coloque as lâminas de tecido na placa de vidro de incubação, evitando a submersão no ácido fórmico e trate por 6 min.
- Tire uma imagem óptica das amostras usando um scanner de filme, scanner de gel ou um microscópio digital, etc. Execute esta etapa em temperatura ambiente. O alinhamento da imagem óptica das amostras é necessário quando o alvo da amostra é colocado dentro do instrumento. Normalmente, não será possível reconhecer a seção de tecido abaixo da camada da matriz.
NOTA: A maneira mais conveniente de tirar uma imagem óptica é usar um scanner de escritório. É uma boa ideia salvar a imagem na pasta de armazenamento de dados de imagem.
- Para correlacionar as imagens ópticas com as amostras, faça marcas de guia visíveis na imagem óptica e abaixo da camada de matriz na óptica da câmera. A maneira mais fácil é identificar pelo menos três marcas de fluido de correção ao redor da amostra antes de tirar a imagem óptica.
- Aplicação matricial
- Preparação da solução matricial
- Em um microtubo tolerante a solventes orgânicos, prepare uma solução de ácido sinapínico (SA) a 10 mg / mL em acetonitrila a 50% (ACN) e TFA a 0,1%. Dissolva completamente o composto SA por vórtice ou breve sonicação por 10 min. Armazene a solução em temperatura ambiente até o uso.
NOTA: Existem três opções diferentes para pulverização de matriz: usando um aerógrafo, um pulverizador ultrassônico ou um pulverizador automático.
- Pulverizando a matriz com um aerógrafo
- Execute a operação em temperatura ambiente constante (20–23 °C) e umidade (40%–60%). Os parâmetros a serem ajustados para uma pulverização ideal incluem o tamanho da gota, a quantidade de névoa, o ângulo e a distância entre o bico de pulverização e a seção do tecido e a temperatura e umidade do laboratório. Ajuste essas condições verificando os resultados da microscopia.
nota: Como os fatores limitantes incluem o tamanho do cristal e a homogeneidade da cobertura da matriz e a indesejável migração/difusão de analitos, quanto menor, melhor para o tamanho da gota. A homogeneidade também é o ponto de inspeção.
- Pulverizando a matriz com um pulverizador ultrassônico
- Remova o tecido a ser pulverizado do dessecador e coloque-o na câmara. Certifique-se de que o tecido não esteja cobrindo a janela do sensor.
- Comece a preparação pressionando o botão Iniciar; geralmente, o tempo de preparação é de cerca de 90 minutos. A preparação será regulada automaticamente através do monitoramento da espessura da camada de matriz e umidade. Após a conclusão da preparação, remova a lâmina e guarde-a no dessecador por 15 minutos antes de lê-la no instrumento MALDI.
- Limpe o pulverizador com 2–3 mL de metanol 100% (MeOH) até que a cabeça de pulverização pareça limpa.
nota: Uma fina névoa de gotículas de matriz pode afundar no tecido por uma folha gravitacional. Um tamanho médio de gotícula de 20 μm é gerado; Todos os diâmetros de gotículas são inferiores a 50 μm.
- Pulverizando a matriz com um pulverizador automático
- Pulverize a solução da matriz na superfície do tecido com um pulverizador automático. Um fluxo constante de gás de bainha aquecido (N2, definido em 10 psi e 75 °C) será fornecido em conjunto com a pulverização da solução da matriz. Use um sistema de bomba de solvente (ajustado para 10 psi e 0,15 mL/min) para fornecer a solução de matriz.
nota: Mais importante ainda, trabalhe sob um gabinete de segurança para evitar qualquer inalação de aerossóis de matriz. Controle a temperatura e a umidade ambiente para reproduzir a cristalização homogênea da matriz.
2. MALDI-IMS
- Realize espectrometria de massa de ultra-alta velocidade.
- Realize experimentos de imagem de alto rendimento e alta resolução espacial com MALDI-IMS equipado com um laser de granada de ítrio-alumínio dopado com neodímio de 10 kHz (Nd:YAG, 355 nm).
- Para medições de espectrometria de massa, defina as áreas do tecido usando o software de controle MALDI e o software de análise de dados.
- Adquira espectros em um modo linear positivo com uma faixa de massa de m / z 2.000–20.000 e uma resolução espacial de 20 e 100 μm.
- Para fazer o padrão de calibração, dissolva o padrão de calibração de peptídeos e o padrão de calibração de proteínas com uma proporção de 1:4 com ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico (CHCA) em solução TA30 (ACN:0.1% TFA = 30:70) e depois dilua-o 10x. Coloque 1 μL de padrão de calibração na lâmina em quatro locais diferentes.
- Usando um software de histologia molecular (consulte a Tabela de Materiais), sobreponha várias imagens únicas para encontrar a correlação espacial de vários sinais, como diferentes peptídeos Aβ colocalizados em placas senis (SPs) e paredes arteriais.