Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Materiais
- Preparação da injeção de lipopolissacarídeo (LPS)
- Adicione 25 mL de água destilada a 25 mg de LPS em pó derivado de Salmonella typhimurium até uma concentração final de 1 mg / mL. Conservar a injecção num tubo estéril a 4 °C.
cuidado: LPS é tóxico.
- Prepare uma solução de azul de Evans (EB) a 2% em solução salina normal a 0,9% para manter a injeção de EB na concentração de trabalho.
2. Animais
Administrar LPS a ratos Sprague-Dawley (SD) machos, com 10 semanas de idade (peso médio: 280 ± 20 g) por injeção intraperitoneal.
cuidado: Se os ratos forem comprados de outra organização, a fase adaptativa não deve ser inferior a 7 dias.
3. Injeções de LPS
- Injete LPS por via intraperitoneal em cada rato na dose de 1 mg / kg e devolva os ratos à sua gaiola de origem.
nota: A anestesia não é necessária.
- Seis horas depois, injete a mesma dose de injeção de LPS nos ratos.
- Dezesseis horas depois, injetar a mesma dose de LPS nos ratos.
cuidado: A injeção de LPS em ratos SD na dose de 1 mg / kg pode resultar em uma taxa de mortalidade de 5%. A taxa de mortalidade pode aumentar ainda mais em ratos mais jovens ou mais velhos ou em ratas grávidas.
- Devolva os ratos às suas gaiolas após a injeção de LPS e forneça acesso ad libitum a alimentos e bebidas.
nota: Os ratos exibirão uma resposta inflamatória sistêmica distinta e, portanto, é essencial que as gaiolas permaneçam limpas durante todo o experimento. Os ratos devem monitorar frequentemente (2x dia) o peso, a aparência geral e a atitude após a primeira injeção de LPS. Se os ratos começarem a exibir uma postura curvada, falta de vontade de se mover, perda de peso significativa (>20%), coloração com porfirina, que sejam sacrificados humanamente antes do ponto final do estudo EB de 7 dias.
4. Coleta de amostras
- Injeção de EB
- Sete dias após a primeira injeção, anestesiar o rato por via intraperitoneal de acordo com o protocolo IACUC aprovado.
- Espere de 1 a 2 minutos até que os ratos não apresentem respostas reflexas da córnea. Realize uma punção cardíaca de 5 a 8 mm de profundidade em cada rato; O ponto de punção deve estar 5 mm à margem esquerda do esterno no 3º e 4º espaço intercostal.
- Aguarde até que a recuperação do sangue seja observada e, em seguida, injete EB na dose de 0,2 mL / 100 g de peso corporal no ventrículo cardíaco esquerdo.
cuidado: A punção cardíaca e a injeção de EB devem ser realizadas com cuidado. A EB pode ser injetada na cavidade torácica ou no pericárdio em vez do ventrículo cardíaco esquerdo.
- Sugue de volta com um tubo vazio e substitua esse volume por um tubo EB antes da injeção para ajudar a reduzir a taxa de falha (por exemplo, injeção na caixa torácica por erro).
- Manter o rato em decúbito dorsal por 10 min.
NOTA: Se a amostra não for usada para detectar vazamento de EB na imagem de imunofluorescência, esta etapa pode ser omitida.
- Observação grosseira
- Realize perfusões cardíacas usando solução salina tampão fosfato 1 M (PBS) gelada para limpar a vasculatura cerebral e o cérebro.
- Usando um bisturi, faça uma incisão abdominal em todo o comprimento do diafragma.
- Corte as costelas à esquerda da linha média da caixa torácica.
- Abra a cavidade torácica. Use grampos para expor o coração e facilitar a drenagem de sangue e outros fluidos.
- Enquanto segura firmemente o coração com uma pinça (o coração ainda deve estar batendo), insira diretamente uma agulha na saliência do ventrículo esquerdo para estendê-la até cerca de 5 mm. Prenda a agulha nessa posição apertando perto do ponto de entrada.
cuidado: Não estenda excessivamente a agulha, pois ela pode perfurar a parede interna e comprometer a circulação das soluções.
- Solte a válvula para permitir o fluxo da solução PBS gelada (200–300 mL) a uma taxa lenta e constante em torno de 20 mL/min usando uma bomba de perfusão. Se os animais necessitarem de fixação em vez de observação macroscópica, use a mesma dose de solução salina a 0,9% gelada.
- Usando uma tesoura afiada, faça uma incisão no átrio, garantindo que a solução flua continuamente. Se o fluido não fluir livremente ou estiver saindo das narinas ou da boca do animal, reposicione a agulha.
- Rastreie CMHs por observação macroscópica.
nota: Se a amostra não for usada no cálculo do número de CMHs por observação macroscópica, essa etapa poderá ser omitida.
- fixação
- Realize perfusões cardíacas usando solução salina a 0,9% gelada (200–300 mL) para limpar a vasculatura cerebral e o cérebro.
- Realize perfusões cardíacas usando paraformaldeído a 4% gelado para fixação.
- Decapite o rato, isole o cérebro e mergulhe o cérebro em solução de sacarose a 20% por pelo menos 6 h.
- Troque a solução por sacarose a 30% e fixe por mais 6 h.
- Prepare seções de tecidos cerebrais de 10 mm de espessura usando um criostato.
5. Coloração de hematoxilina e eosina (HE)
NOTA: Este procedimento é realizado usando um kit de coloração HE.
- Lave as lâminas em água destilada.
- Manchar em solução de hematoxilina por 8 min. Lave em água corrente da torneira por 5 min.
- Diferencie em álcool ácido a 1% por 30 s. Lave em água corrente da torneira por 1 min.
- Manchar em água com amônia a 0,2% (azulada) ou solução saturada de carbonato de lítio por 30 s a 1 min. Lave em água corrente da torneira por 5 min.
- Enxágüe em álcool 95% (10 mergulhos).
- Contra-coloração com solução de eosina por 30 s a 1 min.
- Desidratar com álcool a 95%, duas trocas de álcool absoluto, por 5 min cada.
- Limpar em xileno por 30 s.
- Monte usando o método de Liu.
- Analise usando um microscópio de fluorescência de campo claro.
nota: Os glóbulos vermelhos liberados dos vasos sanguíneos, que são os componentes dos CMHs, aparecem em vermelho-laranja sob a coloração HE.
