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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Cultura de células primárias do hipocampo
- Preparar a cultura de células dissociadas do hipocampo de rato no dia embrionário 19. Plaquear as células em lamínulas de 12 mm revestidas com polietilenoimina (PEI) em placas de 24 poços a uma densidade de 50.000 - 60.000 células/poço. Verifique a densidade usando uma câmara de contagem de células e óptica de contraste de fase.
- Cultivar os neurônios por 3 dias (dia in vitro (DIV) 3) em uma placa de 24 poços na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
- Avalie as lamínulas para indicadores de saúde celular usando microscopia de luz transmitida (por exemplo, óptica de contraste de fase com uma ampliação de 10 a 20X). Verifique os seguintes indicadores de boa saúde: um halo de contraste de fase claro, neuritos sem estruturas frisadas e sem agrupamento de soma ou agrupamento de neuritos.
2. Transfecção
NOTA: O protocolo a seguir refere-se a uma dupla transfecção para 3 poços. No entanto, o protocolo funciona melhor quando são preparadas quantidades suficientes para 4 poços.
- Preparar 500 ml de tampão de transfecção (cloreto de sódio 274 mM, NaCl, cloreto de potássio 10 mM, KCl, hidrogenofosfato dissódico 1,4 mM, Na2HPO4, glicose 15 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico 42 mM, HEPES) num balão Erlenmeyer.
- Dissolver 8,0 g de NaCl, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glicose e 5,0 g de HEPES em 400 mL de água destilada em um frasco Erlenmeyer.
- Ajuste o pH para 6,95 com hidróxido de sódio 1 M, NaOH usando um medidor de pH.
- Ajuste o volume com água destilada para 500 mL e verifique o pH usando um medidor de pH.
- Faça alíquotas de 20 a 30 mL de tampão de transfecção com os seguintes valores de pH pipetando 1 M de NaOH para o tampão de transfecção: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11.
NOTA: O pH do tampão de transfecção é crucial para a eficácia da transfecção.
- Para testar qual tampão de transfecção leva ao maior número de células transfectadas, teste cada valor de pH de 6,96 a 7,11. Utilizar o método de transfecção descrito em 2.2 - 2.11 e um plasmídeo validado que expresse a proteína fluorescente verde (GFP). Determine o número de células transfectadas por lamínula para cada valor de pH do tampão de transfecção para avaliar qual tampão funciona melhor.
- Aliquotar o tampão com a maior eficiência de transfecção em tubos de microcentrífuga de 2 mL Congelar e armazenar os tubos a -20 °C.
- Pré-aqueça o meio de soro reduzido, o meio de cultura celular e a água destilada a 37 °C no banho-maria.
- Prepare a mistura de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Trabalhe sob a coifa de fluxo laminar para garantir condições de trabalho estéreis.
- Misture 7,5 μL de cloreto de cálcio 2 M com 4 μg de cada DNA livre de endotoxinas (Sinaptofisina-mOrange e mGFP/GFP-Rogdi). Adicione água até atingir um volume total de 60 μL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 60 μL de tampão de transfecção à mistura. Para obter os melhores resultados, adicione o tampão de transfecção gota a gota enquanto agita a mistura de DNA suavemente no vórtice.
- Incube em temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evite agitar o tubo de incubação durante o tempo de incubação, colocando o tubo próximo à capela de fluxo laminar.
- Sob a capela de fluxo laminar, remova o meio de cultura de células ("meio condicionado") dos poços usando uma pipeta de 1000 μL e armazene-o em um recipiente separado na incubadora.
- Adicione 500 μL de meio de soro reduzido a cada poço. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 até ao final do período de incubação de 20 minutos (passo 2.3.3).
- Adicione 30 μL de mistura de transfecção a cada poço pipetando várias gotas. Descarte o resíduo no fundo do tubo.
- Depois que todos os poços tiverem sido abastecidos com a mistura de transfecção, agite suavemente a placa de 24 poços para garantir a distribuição da mistura de transfecção no meio.
- Incubar os poços durante 60 minutos a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova e descarte a mistura de transfecção e lave-a três vezes com meio de cultura de células. Adicionar 1 ml de meio de cultura celular a cada alvéolo e incubá-los durante 30 segundos em RT. Retirar 750 μl de meio e adicionar a mesma quantidade de meio fresco. Repita isso três vezes.
NOTA: A etapa de lavagem é crítica. Mantenha o tempo em que cada poço não tenha meio no mínimo (ou seja, remova e substitua poço por poço) e adicione o meio de lavagem suavemente.
- Remover e rejeitar o meio de cultura celular e adicionar 450 μl do meio condicionado poço a alvéolo.
- Deixe os neurônios amadurecerem na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 a DIV 10.
3. Estimulação e captação de Syt1
NOTA: O protocolo a seguir aplica a captação a 3 poços. Para despolarização de qualquer outro número de poços, ajuste as quantidades de acordo.
- Preparar 50 ml de tampão de despolarização 10x (640 mM de NaCl, 700 mM de KCl, 10 mM de cloreto de magnésio, MgCl2, 20 mM de cloreto de cálcio, CaCl2, 300 mM de glicose, 200 mM de HEPES, pH 7,4) num balão Erlenmeyer.
NOTA: O tampão de despolarização pode ser mantido a 4 °C por várias semanas. Se uma solução não despolarizante também for usada, prepare uma solução de Tyrode 10x consistindo de 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM de glicose, 200 mM HEPES pH 7,4 para comparar a reciclagem induzida por estimulação com a reciclagem espontânea. Após diluição a 1x, adicione 1 μM de Tetrodotoxina antes de usar para bloquear a geração de potencial de ação.
- Dissolver 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl2-6H 2O, 0,15 g de CaCl2-2H 2O e 3,0 g de glicose-1 H2O e 2,38 g de HEPES em 50 mL de água destilada em um frasco Erlenmeyer. Ajuste o pH com NaOH e filtre a solução estéril. Dilua o tampão 1:10 em água destilada para atingir uma concentração de 1x.
- Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (pH 7,4) para fixação após a estimulação.
- Para 500 mL de PFA a 4% em 1x PBS, dissolver 20 g de paraformaldeído em 450 mL de H2O. destilado
NOTA: O aquecimento da solução pode acelerar a dissolução, mas não aqueça a solução acima de 70 °C, pois o PFA pode se desintegrar.
cuidado: O PFA é tóxico, potencialmente cancerígeno e teratogênico. Use luvas ao trabalhar com PFA, trabalhe sob a hotte e evite a ingestão.
- Deixe a solução esfriar até RT e adicione 50 mL de solução estoque de PBS 10x. Ajuste o pH para 7.4 com NaOH / HCl (ácido clorídrico) usando um medidor de pH.
- Pré-aqueça 600 μL de tampão de despolarização 1x e 10 mL de meio de cultura celular a 37 °C no banho-maria.
- Adicione 1 μL de anticorpo anti-Syt1 de camundongo (clone 604.2) ao tampão de despolarização 1x e vórtice por 10 segundos.
- Remova e descarte o meio de cultura de células das células. Adicione 200 μL da mistura de anticorpos de despolarização a cada poço e incube por 5 minutos a 37 ° C e 5% de CO2 na incubadora.
- Remover e rejeitar a mistura de anticorpos de despolarização e lavá-la três vezes com meio de cultura celular. Adicionar 1 ml de meio de cultura celular a cada alvéolo e incubar durante 30 segundos a RT. Retirar 750 μL de meio e adicionar a mesma quantidade de meio fresco. Repita três vezes.
- Remova e descarte o meio de cultura celular e adicione 300 μL de PFA a 4% em 1x PBS. Incubar durante 20 minutos a 4 °C.
- Lave três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Imunocitoquímica
- Prepare 50 mL de tampão de bloqueio.
NOTA: O tampão de bloqueio pode ser mantido a -20 °C por vários meses.
- Dissolva 2,5 g de sacarose e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) em 5 mL de solução estoque de PBS 10x. Adicione 1,5 mL de solução de estoque de detergente a 10%. Agitar a solução até que todos os componentes estejam devidamente dissolvidos e adicionar H2O destilado até atingir um volume final de 50 ml. Alíquota a solução e congelar as alíquotas para armazenamento.
- Diluir o anticorpo secundário acoplado ao fluoróforo (dirigido contra a espécie primária de anticorpo Syt1) em 200 μL de tampão de bloqueio em cada poço a uma diluição de 1:1000.
- Remova e descarte o 1x PBS de cada poço contendo uma lamínula.
- Adicione 200 μL de mistura de tampão e anticorpo bloqueador a cada poço e incube por 60 minutos em RT.
cuidado: Como os anticorpos secundários são sensíveis à luz, todas as etapas devem ser realizadas no escuro.
- Após a incubação, lave as células três vezes por 5 minutos com 1 mL de 1x PBS.
- Incorpore as lamínulas nas lâminas do microscópio com o meio de incorporação.
- Adicione uma gota de 7 μL de meio de incorporação na lâmina do microscópio. Remova a lamínula da placa de 24 poços levantando-a com uma seringa e agarrando-a com uma pinça.
cuidado: As células na superfície da lamínula são facilmente danificadas, portanto, as pinças devem ser manuseadas com cuidado.
- Mergulhe a lamínula em água destilada para remover o PBS e seque-a cuidadosamente tocando uma borda no tecido mole.
- Vire a lamínula na gota do meio de incorporação, de modo que a superfície que transporta as células fique voltada para a lâmina do microscópio, incorporando assim as células no meio de incorporação.
- Deixe as lâminas secarem sob o capô por 1 - 2 h (cubra-as para evitar a exposição à luz) e guarde-as em uma caixa de lâminas de microscópio a 4 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.