1. Tratamento de neurônios
Nota: O tratamento foi realizado na Divisão (DIV) 7. Todas as etapas são realizadas sob uma capa de cultura de células em condições estéreis. Um exemplo de densidade de cultura neuronal cortical no DIV 7 é ilustrado na Figura 1.
- Agrupar agregados αS associados a microssomas obtidos da medula espinhal de três camundongos transgênicos doentes diferentes para ter uma solução de 1 μg/μL, usando o tampão de homogeneização original [composto por 250 mM de sacarose, 20 mM de HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico), 10 mM de KCl (cloreto de potássio), 1,5 mM de MgCl2 (cloreto de magnésio), 2 mM de EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), e 1x inibidores de fosfatase/protease] para a diluição.
- Faça uma cultura de neurônios em lamínulas de poli-D-lisina em placas de 24 poços contendo meio (2% de B27, 10x de gentamicina e 2 mM de glutamina). Remova 1/3 do meio e substitua-o suavemente pelo meio fresco contendo 2% de B27, 1x gentamicina e 2 mM de glutamina.
- Adicione 1 μg de agregados de alfa-sinucleína (αS) associados a microssomas agrupados ao meio celular. Retorne os neurônios à incubadora a 37 °C.
- A cada 3 dias durante 1 semana, adicione 1/3 do meio fresco. Não substitua o meio. Basta adicioná-lo.
- Após 1 semana de tratamento, remova 1/3 do meio e substitua-o suavemente pelo meio fresco contendo 2% de B27, 10 μg / mL de gentamicina e 2 mM de glutamina. Repita a cada 3 dias.
- Fixe os neurônios após 2 semanas de tratamento (DIV 21).
2. Imunofluorescência
- Fixe os neurônios com paraformaldeído a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x e sacarose a 5% por 15 min em temperatura ambiente (RT) sem agitar sob uma capela de exaustão química.
- Remova a solução de fixação. Lave brevemente com PBS 1x, 3 vezes.
nota: Execute todas as etapas de lavagem com cuidado, pois os neurônios primários não aderem firmemente às lamínulas de polilisina.
- Permeabilize os neurônios com 0,3% de surfactante não iônico em PBS 1x por 5 min em RT.
- Lave brevemente com PBS 1x, 3 vezes.
- Incube neurônios com 3% de soro fetal bovino (FBS) em PBS 1x por 30 min em RT para bloquear locais de ligação inespecíficos em um agitador orbital.
- Incubar neurônios com anticorpo primário apropriado dissolvido em 3% de FBS em PBS 1x, O/N a 4 °C em um agitador orbital.
NOTA: foram utilizados anticorpos syn303 (1:1.000), αS de camundongo (1:200), pser129-αS (1:1.000) e Tau (1:10.000).
- Remova a solução de anticorpos e lave, brevemente, com PBS 1x, 3 vezes.
- Incube neurônios com anticorpo secundário fluorescente apropriado dissolvido em 3% FBS em PBS por 1 h em RT no escuro em um agitador orbital.
- Remova a solução de anticorpos e lave, brevemente, com PBS 1x, 3 vezes.
- Corar os neurônios com solução de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindo) (0,1 μg/mL em PBS 1x) por 15 min em RT no escuro em um agitador orbital.
- Remova a solução de anticorpos e lave, brevemente, com PBS 1x, 3 vezes.
- Monte as lamínulas em um slide usando um meio de montagem antidesbotamento.
