Um modelo in vitro de lesão por estiramento em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Resumo

Fonte: Phillips, J. K. et al. Método para lesão por estiramento de alta velocidade de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em um formato de 96 poços. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o processo de indução de lesão por estiramento em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCNs). As células são retiradas em uma placa sem fundo de vários poços com uma membrana de silicone conectada. O estresse mecânico controlado é aplicado na membrana para induzir a ruptura do citoesqueleto e danos à membrana celular, induzindo um fenótipo de lesão por estiramento nas células.

Protocolo

1. Fabricação de placas

1. Trate a plasma um topo de placa de 96 poços com um limpador de plasma de 200 W (consulte a Tabela de Materiais) por 60 s em alta potência, colocando-o de baixo para cima dentro do limpador de plasma. Verifique se há um brilho roxo visível através da janela da câmara, o que indica que um plasma efetivo se formou. Esta técnica de colagem é adaptada de Sunkara et al.
2. Dentro de 60 s, coloque o topo da placa em 200 mL de trietoxissilano (APTES) a 1,5% (3-aminopropil) em água deionizada (DI) por 20 min, com o lado inferior para baixo. Esta solução é instável: prepare-a no máximo 60 s antes de introduzir a placa.
   cuidado: Trabalhe com APTES em uma hotte.
3. O plasma trata uma membrana de silicone extraída no limpador de plasma por 60 s em alta potência. Cronometre o tratamento com plasma de modo que não termine mais de 5 minutos antes do final do período de 20 minutos na etapa 1.2.
4. Use uma pinça para posicionar a membrana tratada com plasma em cima de um retângulo de papel manteiga de 7,5 x 11 cm^{e 2}. Alinhe uma placa de alumínio de 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm na parte inferior da placa de fabricação clamp. Alinhe a membrana de silicone e o papel manteiga na placa de alumínio usando uma pinça.
5. Remova os topos das placas do banho APTES e sacuda o excesso de solução. Mergulhe em um banho-maria DI de 200 mL por 5 s e sacuda o excesso de água. Mergulhe em um banho-maria diferente de 200 mL DI por 5 s e sacuda o excesso de água. Recoloque a água nesses banhos antes de mergulhar outro prato.
6. Use ar comprimido para secar completamente o tampo da placa.
7. Coloque a parte superior da placa na parte superior da fabricação da placa clamp. Feche suavemente a braçadeira de fabricação da placa para pressionar a parte superior da placa e o silicone juntos. Clamp por pelo menos 1 h.
8. Deixe a placa curar por 24 h em temperatura ambiente antes de usar, protegida contra poeira.

2. Esticar um prato

1. Limpe os indentadores
   1. Prepare um sonicador tipo banho de 60 W com água DI à temperatura ambiente.
   2. Apoie o bloco de penetração acima do banho do sonicador, invertido de modo que apenas os topos dos penetradores fiquem submersos a uma profundidade de pelo menos 1 mm. Sonicar os penetradores por 8 min a 42 kHz.
   3. Seque os penetradores com ar comprimido.
2. Alinhar o bloco de penetrador
   1. Posicione uma câmera com uma transmissão ao vivo acima do dispositivo de alongamento para que ela fique olhando para baixo na matriz de indentador. Concentre-se na parte superior dos indenters.
      nota: A configuração descrita na Seção 3, "Caracterizando o alongamento da membrana", é uma configuração de câmera possível para esta tarefa.
   2. Prenda uma placa no estágio do dispositivo de lesão usando o stage clamps (Figura 1) e coloque uma luz de teto sobre o dispositivo.
      nota: Consulte a Tabela de Materiais para o software de controle do instrumento.
   3. Inicie o software de controle do instrumento clicando no ícone do software na área de trabalho do computador que está controlando o dispositivo de lesão. Execute o projeto "in_vitro_neurotrauma.lvproj" clicando nele na janela de inicialização. Na janela do projeto, inicie os instrumentos virtuais (VIs) de controle de movimento e rastreador de posição, chamados de 'motion_control.vi' e 'position_tracker.vi', respectivamente, clicando duas vezes neles.
   4. Feche a gaiola ao redor do dispositivo de lesão. Pressione o botão 'seta' no canto superior esquerdo do VI de controle de movimento para executar o VI e clique em 'Near Bottom' para abaixar o stage para dentro de 2 mm de contato com os indentadores. Clique no botão 'Parar' para interromper o VI.
      cuidado: Mantenha as mãos afastadas da maca ao manipular a câmera na gaiola. A gaiola deve ser equipada com um interruptor de porta que forneça energia ao dispositivo de alongamento somente quando a porta da gaiola estiver fechada.
   5. Na janela do projeto, clique com o botão direito do mouse em 'Eixo 1'. Clique em 'Painel de teste interativo'. Na janela que se abre, defina o tamanho do passo para 50 μm inserindo '500' unidades no campo 'Posição de destino'.
   6. Clique no botão verde 'ir' na parte inferior da janela 'Painel de teste interativo' repetidamente até que a placa entre em contato com qualquer recuo. Verifique se há contato na imagem ao vivo exibida pela câmera. Observe a posição vertical do palco relatada no canto superior esquerdo da janela 'Painel de teste interativo'; Esta é a primeira posição de contato.
   7. Abaixe ainda mais (conforme descrito na etapa 2.2.6) até que todos os poços tenham feito contato com os recuadores. Se necessário, mova a câmera para ver toda a placa e mova o stage para cima (especificando uma 'Posição de Destino' negativa) e para baixo. Observe a posição vertical do palco relatada no canto superior esquerdo da janela quando todos os postes estão em contato (esta é a posição de contato total).
   8. Observe a diferença entre as posições de primeiro contato e contato total. Feche o 'Painel de Teste Interativo'. Execute o 'VI de controle de movimento' (consulte a etapa 2.2.4) e clique em 'Top' para levantar o palco. Pare o VI de controle de movimento com o botão 'Stop'.
   9. Quando o palco estiver no topo de seu curso, abra a porta para desativar o dispositivo. Ajuste os parafusos de fixação nos cantos do bloco de penetração. Afrouxe o parafuso de fixação no canto que fez o contato primeiro, para abaixá-lo e aperte o parafuso oposto para levantar o canto que fez o contato por último.
   10. Repita o processo de abaixar o estágio até que a placa entre em contato com os indentadores, inspecionando as imagens de contato quanto à inclinação, levantando o estágio e ajustando (etapa 2.2.9) o bloco do penetrador. Quando o palco e o bloco estiverem alinhados, todos os penetradores farão contato ao mesmo tempo.
   11. Abra a porta para desativar o dispositivo. Insira os parafusos de amarração em seus orifícios no bloco do penetrador e aperte-os. Confirme se o bloco está nivelado com os parafusos de amarração no lugar (etapas 2.2.4-2.2.8). Anote a posição do palco relatada pelo 'Painel de Teste Interativo' quando a placa entra em contato. Esta será a posição zero para experimentos de recuo.
3. Lubrifique os indentadores
   1. Se o bloco penetrador acabou de ser instalado e ainda não foi lubrificado, limpe uma almofada de borracha sólida (7.5 cm x 11 cm x 1.5 mm) e uma almofada de espuma de borracha macia de célula fechada (7.5 cm x 11 cm x 3 mm) com um lenço umedecido em etanol. Deixe-os secar ao ar.
   2. Mergulhe um lenço umedecido em óleo de milho e espalhe-o na almofada de borracha sólida para obter um brilho opaco.
   3. Coloque a almofada de espuma na almofada de borracha sólida para transferir o óleo para a almofada de espuma. Coloque uma placa de alumínio de 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm em cima da almofada de espuma e carregue-a com um peso de lastro de aproximadamente 360 g (por exemplo, 6 tubos cônicos carregados com 45 mL de água cada) para garantir a transferência consistente de óleo da almofada de borracha sólida para a almofada de espuma. Aguarde 10 s para que o óleo seja transferido para a almofada de espuma de borracha.
   4. Mova a almofada de espuma de borracha para a matriz do penetrador. Coloque a placa de alumínio e o peso do lastro em cima dela para garantir a transferência consistente do óleo para as pontas dos indentadores. Aguarde 10 s para que o óleo seja transferido para os indentadores.
   5. Se nenhuma placa tiver sido esticada desde que o bloco penetrador foi montado e lubrificado pela primeira vez, estique uma placa de teste antes de iniciar o experimento. Observação: isso evitará que qualquer inconsistência entre o primeiro trecho e os trechos subsequentes confunda o experimento. Para alongamentos subsequentes, repita apenas os passos 2.3.2-2.3.5 antes de cada alongamento.
4. Esticar um prato
   1. Lubrifique os penetradores conforme descrito na etapa 2.3.
   2. Prenda a placa no stage do dispositivo de lesão com o stage clamps. Se for necessária esterilidade, ajuste a posição da tampa para prender a placa sem expor a superfície de cultura ao ar ambiente.
   3. Abaixe o stage para a posição zero usando o 'motion control VI' (consulte as etapas 2.2.4 a 2.2.6); a posição zero é determinada durante a etapa 2.2.
   4. Altere o nome do arquivo no campo "caminho do arquivo" no 'VI de rastreamento de posição' para um nome de arquivo exclusivo e, em seguida, execute-o com o botão 'seta' no canto superior esquerdo dessa janela.
   5. Defina a profundidade e a duração do recuo (normalmente 1-4 mm e 30 ms, respectivamente, profundidade máxima de 5 mm, duração mínima de 15 ms) nos campos 'Lesão (mm)' e 'Duração da lesão (ms)' no 'painel de controle de movimento VI' clicando nos campos e digitando os valores desejados.
   6. Execute o 'painel de controle de movimento VI' e clique em 'Ferir' para recuar a placa.
   7. Mova o palco para o topo de seu percurso clicando em 'Topo'. Em seguida, pare o VI com o botão 'Stop' e desative o dispositivo de lesão abrindo a porta.
   8. Inspecione o histórico de deslocamento do estágio apresentado no 'rastreador de posição VI' para confirmar se o deslocamento máximo especificado foi aplicado. Clique com o botão direito do mouse no gráfico e clique em 'exportar para Excel'. Clique em 'Arquivo| Salvar' para salvar os dados.

3. Caracterizando o estiramento da membrana

1. Pinte o recesso na parte superior de cada penetrador de branco para fornecer um fundo de alto contraste para videografia de alta velocidade. Cuidado: Não pinte os aros dos penetradores onde eles entram em contato com as placas.
2. Impressão 3D com poli (ácido lático) (PLA), ou de outra forma fabricar, um carimbo cilíndrico com o qual fazer um ponto em cada poço. Faça o cilindro com 5,9 mm de diâmetro e 12,2 mm de altura, com uma saliência cilíndrica de 1,5 mm de diâmetro e 1,0 mm de altura centralizada na parte superior.
3. O plasma trata a placa com o lado direito para cima para ativar a superfície de cultura de células de silicone nos poços por 60 s, conforme mencionado na etapa 2.1.
4. Coloque a placa em uma almofada de borracha ou outra superfície macia. Aplique a pequena saliência no carimbo (consulte a etapa 1.2) com tinta de um marcador permanente. Insira o carimbo no poço a ser testado e bata para garantir uma boa transferência de tinta. Prepare o selo antes de cada poço.
5. Alinhe o bloco de penetração e lubrifique os penetradores do dispositivo de lesão (consulte as etapas 2.2-2.3). Prenda a placa no stage do dispositivo de lesão. Posicione uma luz axial difusa brilhante acima do dispositivo de lesão.
6. Configure uma câmera de alta velocidade em um suporte de lança sobre o dispositivo de lesão, voltado para baixo, com a lente ajustada para o menor número de f-stop, e ligue-a. Inicie o software da câmera no computador conectado à câmera. No menu suspenso de taxa de quadros, selecione 2.000 quadros por segundo e, no menu suspenso do obturador, selecione o tempo de exposição mais rápido que produz imagens de alto contraste. Centralize sobre os poços pontilhados.
   1. Posicione a câmera de forma que o campo de visão contenha 12 poços em uma grade 3 x 4.
      nota: Esse campo de visão oferece um compromisso ideal entre taxa de transferência e resolução para uma imagem de 1.280 × 1.024.
7. Abaixe a placa até o ponto zero (consulte as etapas 2.2.4 a 2.2.6). Clique com um clique no botão de gravação no software da câmera para que ele leia 'trigger in'. Inicie o VI do rastreador de posição (etapa 2.4.4).
8. Ligue a luz axial difusa brilhante. Recue a placa conforme descrito na etapa 2.4.6.
9. Desligue a luz axial difusa brilhante.
10. No computador de controle da câmera, encontre a janela de 30-40 ms da gravação na qual ocorre o recuo: arraste as setas de início e fim na barra de reprodução de vídeo de alta velocidade no software da câmera. Clique em Salvar, defina o nome no campo 'Nome do arquivo', selecione 'TIFF' no campo 'Formato' e clique em 'Salvar'.
    1. Olhe através do . TIF-para imagens dos estados menos esticado (início) e mais esticado (recuo de pico).
    2. Para medir a altura e a largura dos pontos em ambas as imagens, use Fiji para abrir as imagens do menor e do pico de alongamento lado a lado. Usando a ferramenta de seleção retangular padrão, clique e arraste para desenhar uma caixa ao redor de um ponto na imagem de menor alongamento. Meça a altura e a largura com 'Analisar| Medida'.
    3. Repita para o ponto no mesmo poço na imagem de estiramento de pico. Repita para o resto dos poços.
11. Calcule a deformação de Lagrange nas direções x e y da seguinte forma:
    
    nota: Aqui, E_xx é a deformação de Lagrange na direção x, E_yy é a deformação de Lagrange na direção y, X é a largura do ponto, Y é a altura do ponto, _f denota a imagem final (ou seja, a imagem de pico de recuo) e _i denota a imagem inicial (ou seja, a imagem de pré-recuo). Faça a média dos dois valores para determinar a deformação nesse poço.

4. Plaqueamento das células cultivadas

1. Autoclave os silos e pesos de lastro que serão usados para esterilização.
2. O plasma trata as placas com fundo de silicone com o lado direito para cima por 60 s (consulte a etapa 1.1). Mergulhe imediatamente as placas em caixas estéreis contendo 70% de etanol por 15 min.
3. Mergulhe as placas em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) em caixas estéreis separadas por 30 min.
4. Aspire o PBS dos poços. Seque apenas uma placa de cada vez para evitar que os poços percam o tratamento com plasma.
   cuidado: As placas com fundo de silicone fornecem menos feedback tátil do que as placas rígidas ao pipetar e são mais propensas a bloquear a ponta de uma pipeta.
5. Adicione 100 μL de 0,1 mg / mL de poli-L-ornitina (PLO) por poço às placas esterilizadas. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
6. Enxágue os alvéolos duas vezes com 100 μL de PBS estéril, deixando a segunda lavagem nos alvéolos até que a suspensão da célula esteja pronta.
7. Remova o frasco de hiPSCNs do armazenamento de nitrogênio líquido usando luvas de segurança e coloque em gelo seco. Transporte rapidamente o frasco para injetáveis para banho-maria a 37 °C e descongele durante exatamente 3 min. Não gire o frasco para injetáveis.
8. Em uma capa estéril, transfira suavemente o conteúdo do frasco para um tubo cônico de 50 mL usando uma pipeta sorológica de 1 mL.
9. Enxágue o frasco criogênico vazio com 1 mL de meio de manutenção completa em temperatura ambiente (base de mídia + suplemento).
10. Transfira 1 mL de mídia para o tubo de 50 mL gota a gota a cerca de uma gota por segundo. Gire suavemente o tubo enquanto adiciona. Adicione 8 mL de meio de manutenção completa à temperatura ambiente ao tubo de 50 mL a cerca de 2 gotas/s.
11. Tampe o tubo e inverta 2-3 vezes. Conte as células com um hemocitômetro. Calcule o volume do meio adicional necessário para diluir a suspensão celular para 225.000 células/mL.
12. Pipetar suavemente a quantidade de meio (calculada acima) para o tubo de suspensão celular utilizando uma pipeta serológica de 25 ml.
13. Adicione 10 μL de estoque de laminina de 1 mg / mL por 1 mL de suspensão celular com uma micropipeta de 1.000 μL para atingir 10 μg / mL de laminina na suspensão celular. Aspire para cima e para baixo uma vez com a ponta usada para laminina, depois tampe o tubo e inverta o tubo uma vez.
14. Aspire o PBS das placas, uma placa de cada vez. Use uma pipeta multicanal para adicionar 100 μL da suspensão de células hiPSCN a cada poço. Os poços têm uma área de cultura de 0,33 cm², portanto a densidade celular por área é de 67.500 células / cm².
15. Descanse as placas em temperatura ambiente por 15 min após a semeadura para promover a fixação. Para evitar vibrações do ventilador da coifa de cultura estéril, coloque as placas cobertas na bancada do laboratório. Incubar as culturas a 37 °C com 5% de CO₂.
16. Realize uma troca completa de meio em 24 h, reabastecendo os poços com 200 μL de meio de manutenção completa. Realize uma meia troca de meio de 100 μL/poço a cada 2-3 dias.

5. Ferindo culturas

1. Alinhe o bloco de penetração e encontre a posição zero conforme descrito na etapa 2.2. Lubrifique os penetradores conforme descrito na etapa 2.3.
2. Defina o nome do arquivo para o histórico de deslocamento no 'VI do rastreador de posição' (etapa 2.4.4). Defina os parâmetros de lesão no 'Motion Control VI' (etapa 2.4.5).
3. Retire a placa a ser ferida da incubadora e prenda-a no palco. Ajuste a posição da tampa para prender a placa sem expor as culturas ao ar ambiente.
4. Abaixe a placa até o ponto zero (etapas 2.2.4-2.2.6) usando o 'VI de controle de movimento'. Inicie o 'VI do rastreador de posição' (etapa 2.4.4).
5. Use o controle de movimento VI para recuar a placa (conforme descrito na etapa 2.4.6). Para alongamentos simulados, pule apenas esta etapa.
6. Retorne o palco para o topo de sua amplitude de movimento (consulte a etapa 2.4.7). Retorne a placa para a incubadora.
7. Inspecione e salve o traço de deslocamento (como na etapa 2.4.8).

Resultados

Figura 1: Um esquema rotulado do dispositivo de lesão.(A) Vista superior, (B) vista isométrica, (C) vista frontal, (D) vista lateral direita. A barra de escala aplica-se às vistas ortogonais (A, B e D).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
.010 "Folha de Silicone	Fabricação Especializada, Inc	#70P001200010	Folha de polidimetilsiloxano (PDMS)
Brilho	Fisher Científico	#043204
Nunc 256665	Fisher Científico	#12-565-600	Placa de 96 poços sem fundo
Lenços umedecidos Kim	ULINE	S-8115
Limpador de plasma	Harrick Plasma	#PDC-001-HC
(3-aminopropil) trietoxissilano	Sigma-Aldrich	#440140	APTES
Papel pergaminho	Reynolds	N/A
Luz de teto	CCS inc	LFX2-100SW
Fonte de alimentação de luz de cúpula	CCS inc	PSB-1024VB
Unidade de iluminação difusa axial	siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Luz axial difusa
Matriz de LED de alta potência	cree	XLamp CXA2540	Matriz de LED de alta potência
Suporte de LED	Molex	1807200001	Suporte de LED
Fonte de alimentação LED	Significa bem	HLG-320H-36B	Fonte de alimentação de corrente constante
Software FastCam Viewer	Photron		softeware câmera
Câmera Rápida Mini UX50	Photron	N/A	Câmera de alta velocidade
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	Lente de câmera de alta velocidade
0,1 mg/ml de poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	#P4597
iCells	Dinâmica Celular Internacional	#NRC-100-010-001
Mídia iCell	Dinâmica Celular Internacional	#NRM-100-121-001
Suplemento iCell	Dinâmica Celular Internacional	#NRM-100-031-001
Laminina	Sigma-Aldrich	#L2020
atuador de bobina de voz	BEI Kimco	LA43-67-000A
Encoder linear óptico	Renishaw	T1031-30A
servoacionamento	Controles Copley	Xenus XTL
controlador	Instrumentos nacionais	Controlador PowerPC em tempo real cRIO 9024
Chassis cRIO	Instrumentos nacionais	cRIO 9113
módulo de entrada digital	Instrumentos nacionais	NI 9411
Chassi de aquisição de dados	Instrumentos nacionais	NI 9113
LabVIEW	Instrumentos nacionais
hiPSCNs	Dinâmica Celular Internacional