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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Animais
- Manter a linhagem TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) com idade entre 6 e 9 meses em condições padrão em água com temperatura de 26,5 °C e ciclo claro/escuro de 14/10 h.
2. Anestesia Sistêmica Reversível
- Prepare a solução estoque de sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (tricaína) dissolvendo 400 mg de pó de tricaína em 97,9 mL de água do tanque e 2,1 mL de 1 M de solução salina tamponada com Tris (TBS). Ajuste para pH 7,0 com 1 M Tris (pH 9) e armazene a 4 °C no escuro por até um mês.
nota: A tricaína deve ser preparada em água como as condições naturais de vida do animal, de preferência deve ser usada água original do tanque.
- Dilua a solução estoque a 1:25 em água do tanque e use imediatamente.
- Coloque o peixe-zebra em uma placa de Petri de 10 cm contendo 50 mL de solução anestésica até que fique imóvel e não responda a estímulos externos (aproximadamente 2 a 5 min, dependendo do peso e da idade).
- Transfira cada peixe manualmente para um suporte de pino de silicone feito sob medida para tratamento a laser (Figura 1A).
cuidado! Os peixes podem permanecer anestesiados fora do tanque por até 10 minutos apenas.
- Para reverter a anestesia após o tratamento e/ou imagem, coloque o peixe-zebra em um recipiente contendo água do tanque.
- Para apoiar a recuperação, crie um fluxo de água fresca do tanque sobre as brânquias, movendo o peixe-zebra para frente e para trás na água.
3. Lesão focal a laser na retina
NOTA: Um laser de diodo de 532 nm é usado para criar danos à luz focal na retina do peixe-zebra. A configuração experimental do laser permite o estabelecimento de uma lesão retiniana focal reprodutível em peixes-zebra adultos.
- Configure a potência de saída do laser: 70 mW; diâmetro da antena: 50 μm; duração do pulso: 100 ms.
cuidado! O uso de luz laser requer proteção individual adequada e rotulagem da área.
- Aplique 1 a 2 gotas de hidroxipropilmetilcelulose a 2% topicamente no olho antes do tratamento e use uma lente de laser de fundo de olho de 2,0 mm para focar o feixe de mira a laser na retina.
cuidado! As gotas de hidroxipropilmetilcelulose são viscosas e podem causar problemas respiratórios se forem nas brânquias.
- Coloque quatro pontos de laser ao redor do nervo óptico no olho esquerdo e use o olho direito, não tratado, como controle interno.
