Medindo a ativação do receptor de odor usando um ensaio de monofosfato de adenosina cíclico em tempo real

Resumo

Fonte: Zhang, Y. et al., Medição de células vivas da ativação do receptor de odor usando um ensaio de cAMP em tempo real. (2017)

Este vídeo demonstra o protocolo para medir a ativação do receptor de odor em células transfectadas usando um biossensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) e detecção de luminescência. O método é aplicado para estudar interações receptor-ligante e vias de sinalização em neurônios olfatórios.

Protocolo

1. Estimulação e medição da atividade do receptor de odor (OR) usando o ensaio cAMP em tempo real

1. Observe as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de 50-80% por poço e retorne à incubadora.
2. Prepare o meio de estimulação adicionando 10 mM de ácido hidroxietilpiperazineetanossulfônico (HEPES) e 5 mM de glicose à solução salina balanceada de Hank (HBSS).
3. Descongele as alíquotas de substrato de substrato de ensaio cAMP em tempo real no gelo. Armazene o reagente do substrato a -80 °C a 55 μL por tubo em tubos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Use 1 tubo por placa.
4. Prepare a solução de equilíbrio a 2% misturando 55 μL do reagente do substrato e 2750 μL de solução de hbss/hepes/glicose.
5. Espalhe uma camada grossa de papel toalha na bancada. Bata suave e repetidamente a placa de cabeça para baixo na toalha de papel para que o meio de transfecção seja completamente absorvido por ela.
6. Lave as células pipetando 50 μL de HBSS / HEPES / solução de glicose para cada poço.
7. Bata suave e repetidamente a solução HBSS/HEPES/glicose da placa de 96 poços.
8. Pipetar 25 μL de solução de equilíbrio a 2% para cada poço e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 2 h.
9. Preparar previamente soluções de reserva de odor 1 M em dimetilsulfóxido (DMSO) e conservar a -20 °C até à utilização.
10. Antes do final do tempo de incubação, diluir as soluções de estoque de odor para concentrações de trabalho no meio de estimulação HBSS/HEPES/glicose.
    nota: As concentrações das diluições de odor preparadas nesta etapa devem ser duplicadas para obter as concentrações finais corretas em cada poço.
11. Usando um leitor de placa de quimioluminescência e antes da adição de odor, meça o nível de luminescência basal da placa por 2 vezes consecutivas a uma taxa de 1000 ms por poço.
12. Remova rapidamente a placa do leitor de placas, adicione diluições de odor de 25 μL a cada poço e inicie imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 min.
    nota: Pipete com cuidado para evitar contaminar os poços vizinhos ao usar diferentes odores e/ou diferentes concentrações dos mesmos odores na mesma placa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dmso	sigma	D2650
Reagente GloSensor cAMP	Promega	E1290
HBSS, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Muscone	Santa Cruz	SC-200528
Tibeteno de almíscar	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, sem cálcio ou magnésio	Cellgro	21-040-CV
Tubo de PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
Tubo Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf
Tubo cônico de 15 mL 17 mm x 120 mm	Falcão BD	352096
pipetador multicanal de 8 poços e/ou 12 poços	Eppendorf
Placa de cultura de células brancas de fundo plano de 96 poços	Greiner	655098
Placa de cultura de células de 100 mm x 20 mm	Falcão BD	353003
Leitor de chapas F200 infinito	Tecano