Caracterização do espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos íon-seletivos e iontoforese

Resumo

Fonte: Odackal, J., et al. Iontoforese em tempo real com tetrametilamônio para quantificar a fração de volume e tortuosidade do espaço extracelular cerebral. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra como caracterizar o espaço extracelular em uma fatia cerebral usando microeletrodos seletivos de íons e iontoforese para medir e comparar sinais elétricos. Esse processo ajuda a determinar a fração de volume e o grau de torção do espaço.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Iontoforese em tempo real em fatias cerebrais

1. Coloque uma fatia de cérebro de 400 μm de espessura na câmara de registro, certificando-se de que ela esteja totalmente submersa no líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) que flui. Posicione a fatia usando um pincel aquarela e prenda-a suavemente com uma grade.
2. Mova o microeletrodo de iontoforese e o ISM acima do campo de interesse na fatia do cérebro. Mergulhe ambos no ACSF que flui, mas acima da fatia.
3. Deslocar a tensão para os canais de referência e de detecção de íons para "0" mV. Aguarde até que a tensão em ambos os canais se estabilize. No registrador gráfico, marque a tensão medida no canal de detecção de íons do ISM. Use isso para calcular o parâmetro V da linha de base em Wanda.
4. Coloque o microeletrodo ISM e iontoforese a 200 μm de profundidade na fatia e a 120 μm de distância um do outro. Aguarde a estabilização do sinal após mover o microeletrodo para a fatia cerebral.
   nota: A corrente de polarização aplicada ao microeletrodo de iontoforese causa um pequeno acúmulo de tetrametilamônio (TMA). É um erro comum fazer uma gravação muito cedo e subestimar o acúmulo de sinal.
5. No registrador gráfico, marque a tensão estabilizada medida na fatia do cérebro no canal de detecção de íons do ISM. Calcule o voltage diferença entre o sinal TMA medido na etapa 8.3 e na etapa 8.4 e insira esse valor no campo "Linha de base V (mV)" na caixa Eletrodo de medição da GUI Wanda.
6. No lado esquerdo da GUI, certifique-se de que todos os parâmetros experimentais sejam registrados/inseridos corretamente. Defina "Médio" para "Cérebro", "Número de transporte" para o valor médio calculado para o microeletrodo de iontoforese na etapa 7.4 e "Temperatura" para a temperatura do banho que contém a fatia.
   NOTA: V deve ser registrado para cada conjunto de medições. A linha de base V será convertida por Wanda no parâmetro C (mM) da linha de base (ou seja, a concentração de TMA no tecido cerebral).
7. Inicie a gravação clicando em "Adquirir" e permita que ela faça uma gravação completa. Aguarde até que o sinal TMA retorne à linha de base antes de adquirir uma nova gravação.
8. Faça duas a três gravações sucessivas antes de remover os microeletrodos do local cerebral escolhido. Insira a temperatura medida no software Wanda imediatamente antes de cada gravação.
9. Mova os dois microeletrodos diagonalmente de volta para a superfície da fatia. Elevar ambos até, pelo menos, 50 μm acima da fatia. Usando o registrador gráfico, determine qualquer mudança entre o V medido agora e sua medição a partir da etapa 8.3.
10. Centralize as pontas do MI e dos microeletrodos iontoforéticos em relação uma à outra nos eixos x, y e z. Obtenha alterações de espaçamento, se houver, no visor da caixa de controle do micromanipulador.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
amplificador para ISM	Dagan	Pré-amplificador intracelular duplo modelo IX2-700	amplificador de tensão de referência e íon com headstages N = 0,1 (para barril de referência) e N = 0,001 (para barril de íons)
miscroscópio de compostos biológicos (com objetiva de 4x e 10x)			para lascar as pontas dos microeletrodos e inspecionar microeletrodos; vários fornecedores, por exemplo, AmScope
tubo de vidro capilar de borosilicato	Aparelho de Harvard	Warner Instruments modelo TG200-4; pedido #64-0811	de vidro de barril duplo para microeletrodos íon-seletivos e microeletrodos iontoforéticos; diâmetro externo 2,0 mm, diâmetro interno 1,4 mm, septo 0,2 mm, comprimento 10 cm
Gravador gráfico			para registrar continuamente tensões em microeletrodos seletivos de íons durante a calibração em padrões de tetrametilamônio e durante o experimento RTI; por exemplo, gráfico de canal duplo Kipp & Zonen tipo BD112 gravado, disponível recondicionado
Software comercial	A MathWorks	MATLAB, caixa de ferramentas de aquisição de dados	para aquisição e análise de dados utilizando os programas de Wanda e Walter. Observe que uma licença acadêmica está disponível.
óculos de proteção para os olhos	pescador
microscópio composto de estágio fixo	Olimpo	BX51WI	pode usar outros microscópios compostos com estágios fixos
fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	#11251-10	para lascar o capilar de vidro; Dumond # 5, de preferência usado e não mais necessário para trabalhos finos
unidade iontoforética	Dagan	ION-100 e PS-100	O ION-100 é uma unidade de iontoforese de canal único +/- 130 V de conformidade; PS-100 é uma fonte de alimentação externa; alternativas: por exemplo, Axoprobe-1A fabricado pela Axon Instruments (agora Molecular Devices), fora de produção, verifique a disponibilidade de unidades recondicionadas (eBay e outros sites)
suporte de microeletrodo	WPI	M3301EH	para segurar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado para silanização e enchimento da ponta do barril íon-seletivo com trocador de íons líquido; A WPI vende duas versões deste suporte, M3301EH transparente e M3301EH preto. Em nossa experiência, o M3301EH transparente parece ser mais resistente do que o M3301EH preto.
micromanipulador	Narishige	MM-3	para posicionar o microeletrodo íon-seletivo pré-fabricado durante a silanização e o enchimento da ponta do barril íon-seletivo com trocador de íons líquido; pode ser substituído por qualquer micromanipulador de três eixos em boas condições de trabalho
Objetiva 5x seca	Olimpo	MPlan N
Objetiva 10x Imersão em água	Olimpo	UMPlan FL N	A objetiva de 10x é imersão em água, a abertura numérica é de 0,3, a distância de trabalho é de 3,3 mm
Plataforma e platina de translação XY para microscópio de platina fixa	EXFO	Gibraltar Burleigh	A plataforma segura a câmara da fatia, os micromanipuladores e os accesorries, microplaqueta translacional de X-Y movem o microscópio sem comprometer a estabilidade da gravação
Micromanipulador robótico com posicionamento preciso de X, Y, Z	Instrumentos Sutter	MP-285	Dois micromanipuladores são necessários para segurar separadamente o microeletrodo íon-seletivo e o microeletrodo iontoforético. Também é possível colar micropipetas em uma matriz espaçada (ver texto).
Unidade de condicionamento de sinal com filtro passa-baixo	Axônio Instrumentos	CyberAmp 320 ou 380	não está mais disponível no fabricante, mas pode estar disponível no E-Bay; alternativas: por exemplo, Filtro/Amplificador FLA-01 da Cygnus Technology. Este é um instrumento de canal único com um corte mínimo de 10 Hz usando um filtro Bessel multipolar, mas a empresa pode estar disposta a modificá-lo para uma frequência de corte mais baixa (2 Hz), se necessário.
fio de prata	Sistemas A-M	#7830	diâmetro 0,015", nu (sem revestimento)
Câmara de fatia	Aparelho de Harvard	Warner Modelo RC-27L	Esta é a câmara de fatia de submersão; não use a interface da câmara de fatia
estereomicroscópio			para silanização e enchimento da ponta do barril íon-seletivo com trocador de íons líquido; montado horizontalmente; vários fornecedores
cloreto de tetrametiamônio (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	Solução 5 M; CUIDADO: toxicidade aguda (oral, dérmica, inalatória), carcinogenicidade, perigosa para o ambiente aquático, consulte as informações de segurança da Sigma-Aldrich para obter a descrição completa

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