Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Procedimento cirúrgico
Nota: 20 ratos Sprague-Dawley machos foram microinjetados com proteína beta amilóide composta (Aβ) no ventrículo lateral e no núcleo talâmico anterodorsal e designados como o grupo composto tratado com Aβ. Outros 20 ratos foram submetidos à mesma operação, mas receberam microinjeção de solução salina de dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,1% e foram designados como o grupo operado de forma simulada.
- Anestesie os ratos com isoflurano a 100% por inalação e, em seguida, contenha-os em um aparelho estereotáxico cerebral.
- Raspe o pelo no vértice da cabeça com uma tesoura cirúrgica e desinfete com iodóforo. Em seguida, cubra uma toalha cirúrgica descartável na cabeça.
- Faça uma incisão na pele da cabeça ao longo da calvária longitudinal mediana com bisturias cirúrgicas e tesouras.
- Separe o tecido subcutâneo e a fáscia, limpe a calvária do crânio com algodão seco estéril para estancar o sangramento e marque o bregma com um marcador.
- Consulte o Mapa Estereotáxico do Cérebro de Rato considerando o bregma como ponto de origem, marque os três pontos, o núcleo talâmico anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm ao bregma; lateral (L): 1,4 mm à linha média) para injetar o fator de crescimento transformador humano recombinante-β1 (RHTGF-β1) e fixar um parafuso, a área do ventrículo lateral (VE) (posterior (P): 0,8 mm para o bregma; lateral (L): 2,0 mm em relação à linha média) para injeção de proteína beta amiloide 25-35 (Aβ25-35) e tricloreto de alumínio (AlCl3), e o segundo local de fixação do parafuso (Frente (F): 2,0 mm em relação ao bregma; lateral (L): 1,5 mm em relação à linha média).
- Faça cuidadosamente três furos de 1 mm de diâmetro com uma broca óssea flexível designada nos três pontos acima do crânio (passo 1.5.). Não aperte mais fundo do que o necessário para evitar esfaquear o tecido cerebral.
- Pare o sangramento e limpe a superfície do crânio repetidamente com algodão seco estéril.
- Insira uma agulha ligada à bomba de microinjeção no cérebro a 4,6 mm de profundidade e injete suavemente 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) na área de anúncio. Fique a agulha por 2 minutos após a injeção e puxe lentamente a agulha.
- Fixe os dois parafusos no crânio, designados nos pontos do anúncio, e o segundo local de fixação do parafuso do crânio (que foi designado em 1,5. passo) com uma pequena chave de fenda. Não aperte mais fundo do que o necessário para evitar esfaquear o tecido cerebral.
- Monte o sistema de implantação da cânula e insira a cânula fictícia na cânula guia após a desinfecção por alta pressão.
- Insira a cânula guia do tubo de aço inoxidável no cérebro a 4,6 mm na área do VE através do orifício do crânio com a ajuda do suporte da cânula do aparelho estereotáxico dos ratos.
- Misture o material da base da prótese com água da base da prótese na proporção de 1,5 g por 1 mL, coloque a pasta para cobrir o pedestal de plástico da cânula guia e dois parafusos para imobilizar a cânula guia e cobrir toda a incisão da pele para evitar infecção da pele.
- No 2º dia da operação, os ratos foram anestesiados com inalação de isoflurano usando o aparelho de anestesia para pequenos animais. Retire a cânula fictícia, insira a cânula interna na cânula guia e aperte o parafuso de fixação para imobilizar a cânula interna.
- Defina o tubo de polietileno que liga a bomba de microinjeção à cânula interna e regule a velocidade de injeção para 1 μL/min. Microinjete o Aβ25-35 ou AlCl3 no LV.
- Microinjetar 4 μg (1 μL) de Aβ25-35 diariamente por 14 dias pela manhã e 3 μL de AlCl3 (1%) diariamente por 5 dias à tarde sob anestesia com isoflurano.
- Aguarde 5 minutos após terminar a injeção, retire suavemente a cânula interna e insira a cânula fictícia novamente na cânula guia.
- No dia 15, pós-operatório (que corresponde ao último dia de injeção de Aβ25-35), desmonte o sistema de implantação da cânula. Remova suavemente o material de base da prótese sólido com tesoura cirúrgica e pinça, desparafuse os dois parafusos, puxe a cânula guia e desinfete a ferida com betadine. Preencha o orifício do crânio com cimento ósseo e suture a pele usando um método simples de sutura interrompida.
- Realize a mesma operação com o grupo operado de forma simulada e microinjete solução salina DMSO a 0,1%.
