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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Abrasão da almofada do pé do mouse
- Anestesiar um camundongo C57BL/6 (5–7 semanas de idade) com anestésico gasoso isoflurano, administrado na dosagem de 3% por meio de um pequeno sistema de anestesia (câmara).
- Coloque o camundongo no plano cirúrgico da anestesia de costas, antes da inoculação, na pata traseira. Prenda um cone nasal com um diafragma (uma fenda suficientemente dimensionada para caber no focinho do animal) ao camundongo e administre o anestésico gasoso isoflurano em uma dosagem constante de 1,5% a 2,0%.
- Monitore de perto o mouse quanto a uma resposta ao estímulo doloroso criado pelo beliscão forte do dedo do pé com uma pinça.
- Segure levemente uma almofada do pé traseiro com uma pinça plana.
- Lixe suavemente a pele glabra da pata traseira aproximadamente 20x, entre o calcanhar e as almofadas de caminhada, com uma lixa (grão 100–180). Não induza sangramento por abrasão com muita frequência ou aplicação de muita pressão.
- Usando uma pinça fina, retire lentamente o estrato córneo destacado por abrasão para expor o estrato basal.
2. Inoculação da pata PRV
- Prepare o inóculo do vírus diluído até o título desejado em meio DMEM contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (Tabela de Materiais).
- Quantificar o número de unidades formadoras de placas (PFU) no estoque de vírus em células PK15 para calcular e padronizar a dose viral e diluir o inóculo viral de acordo.
nota: Neste estudo, a cepa virulenta de PRV (PRVBecker) foi usada na dose de 8 x 106 PFU. Esta dose foi otimizada em um experimento preliminar anterior para garantir que todos os animais inoculados apresentassem sintomas clínicos 82 h pós-inoculação (hpi).
- Mantenha o inóculo do vírus no gelo e misture delicadamente antes de usar.
- Adicione uma gota de 20 μL de inóculo viral (8 x 106 PFU) na almofada do pé desgastada (administração tópica). Realize inoculações simuladas (somente meio) em paralelo.
- Esfregue suavemente 10x com a haste de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus. Evite coçar com a ponta da agulha. Repita esta etapa a cada 10 minutos.
- Mantenha o mouse sob anestesia por 30 min até que a almofada do pé desgastada esteja seca.
- Após interromper a anestesia, monitore o camundongo até que ele possa manter a decúbito esternal e coloque-o em uma gaiola individual para acompanhamento clínico e amostragem.