Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
C57BL/6 (H-2b) camundongos fêmeas, 8 semanas de idade, foram comprados e camundongos C57BL/6 AQP4-/- foram fornecidos por A. Verkman.
1. Imunização de camundongos com peptídeos AQP4
- Prepare o estoque de trabalho adjuvante de Freund (CFA) completo.
- Moer finamente uma preparação desidratada de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) usando um almofariz e pilão.
- Adicione H37Ra moído ao adjuvante de Freund incompleto a uma concentração final de 4 mg / mL. O CFA pode ser armazenado a 4 °C por até 6 meses.
- Dissolva o peptídeo AQP4 do antígeno liofilizado (Ag) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) até uma concentração final de 1 mg / mL. Manter a 4 °C ou sobre gelo.
- Preparar o conjunto de 2 seringas luer-lock, unidas a uma torneira, contendo a emulsão CFA/peptídeo.
- Conecte uma seringa luer-lock de vidro sem êmbolo a uma torneira de nylon de 3 vias com 2 conexões luer-lock macho. Feche a torneira girando a alavanca em direção à seringa. Posicione a extremidade aberta da seringa para cima, permitindo que a seringa atue como um tubo de ensaio. Coloque-o em um rack de tubos para maior estabilidade.
- Vortex, o estoque de giro CFA e a solução Ag. Adicione um volume de 1:1 de peptídeo / CFA à seringa aberta. São necessários 200 μL de CFA/Ag (4 x 50 μL) por mouse.
nota: Normalmente, cerca de 1 mL de preparação é perdido na torneira, o que reduzirá a quantidade disponível para imunização. Portanto, é importante incorporar isso no cálculo do volume total necessário.
Exemplo: Para imunização de 5 camundongos: (200 μL/animal x 5 animais) + 1 mL de volume extra = 2 mL de CFA/Ag total necessário.
- Insira o êmbolo de vidro na seringa e, enquanto o segura no lugar, inverta a seringa de modo a que a torneira fique orientada para cima. Mude a alavanca da torneira para a conexão fêmea não utilizada. Aplique pressão cuidadosamente no êmbolo de vidro para remover o excesso de ar da seringa. O líquido preenche a segunda conexão luer-lock macho da torneira.
- Encaixar uma segunda seringa de vidro (êmbolo totalmente inserido) à segunda ligação luer-lock macho da torneira. Este deve ser um sistema fechado de 2 seringas de vidro conectadas a uma torneira contendo o mínimo de excesso de ar possível.
- Para criar uma emulsão, misture empurrando os êmbolos para passar o líquido alternadamente entre as 2 seringas por cerca de 2 min. Refrigere as seringas no gelo por cerca de 10 min. Repita o resfriamento e a mistura até que haja uma mudança clara na viscosidade da preparação, resultando em uma emulsão branca e muito dura. Refrigerar as seringas que contêm a emulsão a 4 °C ou mantê-las congeladas.
- Transfira toda a emulsão para uma seringa de vidro luer-lock, retire a seringa de vidro vazia e substitua-a por uma seringa luer-lock de 1 ml para injeção. Encha a nova seringa com emulsão, retire-a da torneira e coloque uma agulha (25G x 5/8).
- "Teste a água" da emulsão quanto à consistência. Expulse uma gota da emulsão em um pequeno prato com água. A emulsão não deve dispersar-se, indicando que é adequada para injeção.
- Se a emulsão se dispersar, não está pronta para injeção; transfira o líquido de volta para as seringas de vidro e continue a misturar e depois resfrie novamente até que a emulsão fique firme.
- Teste a emulsão novamente até obter a consistência adequada.
- Injetar os ratinhos doadores AQP4-/- por via subcutânea (s.c.) com uma emulsão contendo o peptídeo AQP4. Cada camundongo recebe 4 x 50 μL s.c. injeções (200 μL no total (100 μg de peptídeo)). Os 4 locais incluem ambos os lados do abdome inferior, que drenam para os linfonodos inguinais (NL), e ambos os lados da parede torácica medial a cada axila, que drenam para NL axilar. A transferência adotiva exigirá 1-2 camundongos doadores imunizados por camundongo receptor.
2. Cultura de células T e polarização de células T pró-inflamatórias
- 10-12 dias após a imunização, colete LN dos camundongos.
- Numa bandeja de gelo, preparar placas de Petri de 60 mm equipadas com um filtro de células (malhagem de 70 μm) e contendo meios refrigerados do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor (FBS) e 100 U/ml de penicilina-100 μg/ml de estreptomicina (caneta-estreptococos) (RFPS).
- Eutanásia de camundongos por exposição ao CO2, seguida de luxação cervical. Mergulhe os ratos em etanol a 70% e, em seguida, prenda cada almofada de pé em uma placa de dissecação.
- Corte uma incisão na linha média da virilha até o pescoço e desça cada perna. Puxe a pele para longe do peritônio e prenda-a firmemente na placa. Dissecar o LN inguinal e axilar e colocá-lo na placa de Petri contendo RFPS, no gelo.
- Para experimentos de transferência adotiva, combine LN de todos os animais dentro do mesmo grupo de imunização. Para análises de citometria de fluxo do uso de Vβ, separar a LN de animais individuais.
- Coloque o filtro de célula contendo o LN em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo RFPS. Use a extremidade plana de um êmbolo de seringa estéril de 5 mL para pressionar as células LN através do filtro, lavando com 20-30 mL de RFPS para facilitar a recuperação das células. Mantenha as células LN no gelo durante todo o processamento até o momento da cultura.
- Lave duas vezes, centrifugando a 393 x g por 5 min. Após a segunda lavagem, ressuspenda as células LN em meio de células T (TCM). A MTC contém RPMI com 10% de FBS inativado por calor, 292 μg/mL de L-glutamina, 110 μg/mL de piruvato de sódio e 55 μM de 2-mercaptoetanol e caneta-estreptococo. Normalmente, é usado um volume de 5 mL de TCM por camundongo doador.
- Conte as células LN. O rendimento esperado é de aproximadamente 3-6 x 107 células LN por doador de camundongo imunizado.
- Configure culturas polarizadoras para transferência adotiva.
- Prepare uma cultura polarizadora Th17 de 5 x 106 células LN por mL com 10 μg/mL de Ag, 20 ng/mL de interleucina recombinante de camundongo (IL)-23 e 10 ng/mL de IL-6 de camundongo recombinante em MTC.
- Alternativamente, para polarização Th1, prepare uma cultura de 5 x 106 células LN por mL com 10 μg / mL Ag e 10 ng / mL de IL-12 de camundongo recombinante em TCM.
- Adicione 2 mL (1 x 107 células) por poço da mistura de cultura polarizadora em uma placa de 12 poços. As células LN de 2-4 camundongos doadores preencherão uma placa de 12 poços. Mantenha as culturas em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 por 72 h.
- Verifique visualmente as células LN em cultura para ativação em 48 h e 72 h. As células ativadas formarão aglomerados extensos e as células T aumentarão de tamanho, tornando-se mais pleomórficas. O aumento do metabolismo causará uma redução do pH no meio, mudando de pêssego para laranja. Se o pH for baixo o suficiente para tornar o meio amarelo, adicione 1 mL de TCM fresco para evitar toxicidade para as células nas 24 horas restantes.
- Prossiga para a transferência adotiva.
3. Transferência Adotiva de Células T patogênicas específicas para AQP4
NOTA: Esta etapa segue a Seção 2.5: Cultura de células T e polarização de células T pró-inflamatórias.
- Recupere células polarizadas de placas de 12 poços pipetando para cima e para baixo para desalojar e transferindo-as para um tubo de 50 mL. Mantenha no gelo até as injeções.
- Conte as células, lave-as duas vezes em PBS frio e prepare uma suspensão de 1 x 108 células / mL em PBS. Geralmente, injete células dentro de uma hora.
- Misture suavemente as células girando-as e transfira-as para uma seringa de 1 mL no momento da injeção. Administrar 200 μL das células (2 x 107) por via intravenosa (i.v.) a cada camundongo, através da veia da cauda.
- Injete em cada camundongo receptor i.p. 200 ng de toxina B. pertussis diluída em 200 μL de PBS naquele dia e 2 dias depois. Monitore os ratos diariamente em busca de sinais de doença clínica.
