Coloração Imunofluorescente de Populações Neuronais no Trato Gastrointestinal Murino Embrionário

Resumo

Fonte: Barlow-Anacker, A. J., et al., Imunocoloração para visualizar o desenvolvimento do sistema nervoso entérico murino. J. Vis. (2015)

Este vídeo demonstra a imunomarcação do trato gastrointestinal murino embrionário para visualizar e analisar a distribuição da população neuronal usando imunofluorescência e microscopia confocal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Protocolo de imunocoloração

1. Se as amostras foram armazenadas em sacarose a 30%, enxágue-as 3 vezes por 20 min em 1x PBS em uma plataforma de balanço.
2. Coloque os tratos gastrointestinais na solução de bloqueio em uma plataforma de balanço por 1h em RT.
3. Remover a solução de bloqueio e incubar os tractos gastrointestinais com a quantidade adequada de anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio durante 4 horas a RT ou O/N a 4 °C numa plataforma de balanço. Use uma diluição de 1:1.000 de anticorpo anti-Hu humano (soro obtido do paciente), uma diluição de 1:1.000 de anticorpo anti-proteína fluorescente verde (GFP) de frango e uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-ChAT de cabra.
   nota: Utilizamos um anticorpo humano anti-Hu obtido localmente de um paciente; no entanto, anticorpos anti-Hu estão disponíveis comercialmente, por exemplo, anti-Hu em camundongos (use em diluição de 1:500).
4. Enxágue os tratos gastrointestinais em 1x PBS 3 vezes por 5 min e depois por 1 hora em RT em uma plataforma de balanço.
5. Substitua o PBS 1x por anticorpos secundários diluídos a 1:500 em solução de bloqueio em uma plataforma de balanço por 4 horas em RT ou O/N a 4 °C. Use corante anti-reativo de amina humana de burro, como Dylight, anti-frango Cy2 de burro e anti-cabra de burro Cy5. Se estiver usando o anticorpo anti-Hu de camundongo, use uma diluição de 1:500 de corante anti-amina-reativo de camundongo de burro 405.
   nota: A intensidade da expressão endógena de GFP e tdTomato e a clareza da imunocoloração aumentam com a idade de desenvolvimento. Normalmente, imunomarcamos intestinos embrionários individualmente em tubos de 0,2 ml com 150 μl de solução de coloração para reduzir o volume de anticorpo usado e também para garantir uma coloração eficiente do tecido.
6. Enxágue os tratos gastrointestinais em 1x PBS 3 vezes por 5 min e depois por 1 hora em RT em uma plataforma de balanço.
7. Coloque algumas gotas de meio de montagem de fluorescência com DAPI em uma lâmina de vidro. Mergulhe o trato gastrointestinal no meio de montagem de fluorescência e adicione uma lamínula diretamente sobre o tecido. O meio de montagem de fluorescência -G é um composto solúvel em água que fornece uma vedação semipermanente.
   nota: Use um meio de montagem de fluorescência, como o Vectashield, um meio de montagem à base de glicerol que evita o desbotamento de anticorpos e o fotobranqueamento. Ambos os produtos permitem que os tecidos sejam armazenados por longos períodos de tempo a 4 °C.
8. Capture imagens de cada fluoróforo usando um microscópio confocal. Use os comprimentos de onda de excitação para fluoróforos e filtros empregados na Tabela 1.
9. Realize a análise de imagem auxiliada por computador usando o software apropriado, dependendo do tipo de confocal usado para capturar imagens.

Tabela 1: Comprimentos de onda de excitação de imagem confocal, fluoróforos e filtros. Os comprimentos de onda de excitação, fluoróforos detectáveis e filtros empregados são apresentados. Essas informações podem ser usadas na escolha de combinações de anticorpos secundários para imunofluorescência multicolorida.

Excitação			Emissão
Linha Laser	Tipo de fluoróforo	Exemplos	Tubo fotomultiplicador	Opções de filtro
408 nanômetro	azul	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, a maioria dos pontos quânticos	1	BP 425-475 nanômetro
488 milhas náuticas	verde	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Verde Oregon, YO-PRO-1	algarismo	BP 500-550 nanômetro
561 nanômetro	vermelho	Alexa Fluor 546, 555, 568 e 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Ficoeritrina (PE), Propídio Iodo (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nanômetro
638 milhas nanômetro	Vermelho Distante	Alexa Fluor 633 e 647, Aloficocianina (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato	Oxóide	BR0014G
Albumina de soro bovino	pescador	BP1605
Tritão X-100	sigma	100 X
Escopo de fluorescência	Nikon	Estereoscópio SMZ-18
Tubos Eppendorf de 1,5 mL	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	Nº 0100-01
Lâminas de vidro	pescador	12-550-15
Vidro de cobertura	VWR	16004-330
Microscópio confocal	Nikon	Nikon A1
Elementos Nikon	Nikon