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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Modelo Animal
- Camundongos Tg hemizigotos (Gfap-luc+/-) intercruzados (camundongos transgênicos que expressam luciferase de vaga-lume) com camundongos Tg(M83+/-) hemizigotos (camundongos transgênicos que expressam alfa-sinucleína humana com a mutação familiar A53T) para gerar camundongos Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) bigênicos hemizigotos.
- Genótipar a progênie com reação em cadeia de poliesmerase (PCR) em tempo real para a presença do transgene que codifica a alfa-sinucleína humana e com PCR padrão para luciferase de vaga-lume.
- Inocular os animais com uma idade de seis a oito semanas.
2. Preparação do inóculo
- Preparar alfa-sinucleína humana recombinante monomérica com a mutação A53T em tampão salino tampão tampolado com Tris (TBS) contendo 150 mM de NaCl em 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
- Preparar a alfa-sinucleína fibrilar para as inoculações, agitando 3 μg/μL de alfa-sinucleína humana recombinante monomérica num agitador orbital a 800 rpm e a 37 °C durante 5 dias.
- Dilua os conjuntos de fibrilas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para atingir uma concentração final de 1 μg/μL para inoculações intraperitoneais.
- Fragmente as fibrilas de alfa-sinucleína com um sonicador de bastonete por 1 min (40 pulsos de duração de 0,5 s com uma pausa de um segundo entre cada pulso e uma amplitude definida para 50%) no gelo. Para evitar a contaminação por semeadura cruzada, use sondas de sonicação limpas para preparar diferentes inóculos.
3. Injeções intraperitoneais
- Para injeções intraperitoneais, narcotizar os animais brevemente em uma câmara de anestesia por inalação com isoflurano/oxigênio usando uma taxa de fluxo de 2 L/min e o vaporizador ajustado para 2%. Aperte o dedo do pé do animal e confirme se ele não retira o membro posterior para garantir a anestesia adequada.
- Encha uma seringa hipodérmica descartável de 27 G com 50 μL de fibrilas de alfa-sinucleína sonicadas ou PBS.
- Injete diretamente no peritônio do camundongo e evite penetrar no intestino delgado ou ceco localizado atrás da parede abdominal, mantendo o animal em posição dorsal com a cabeça voltada para longe do investigador e para baixo a aproximadamente 45°. Monitore os animais até que eles se recuperem da anestesia.