1. Monitoramento da disseminação transcelular de proteínas semelhantes a príons por imagens de lapso de tempo in vivo
NOTA: Cultive linhagens de C. elegans de tipo selvagem (WT) (N2) e transgênicas de acordo com métodos padrão e controle cuidadosamente a temperatura de cultivo.
- Gerar linhagens transgênicas de C. elegans expressando a proteína semelhante a príon, marcada com uma proteína fluorescente vermelha monomérica (mRFP).
- Preparar populações sincronizadas por postura ou branqueamento de acordo com métodos padrão.
- Sincronização por postura
- Transfira 10 a 20 adultos grávidos em um prato e deixe-os botar ovos por 1 a 2 horas. Retire os adultos do prato e deixe a progênie crescer até a idade desejada.
- Sincronização por branqueamento
- Colete uma população não sincronizada de adultos grávidas e branqueie-os com uma solução alcalina de hipoclorito (hidróxido de sódio (NaOH) a 250 mM e diluição 1:4 (v/v) de alvejante comercial em água (H2O)). Lave os ovos duas vezes (218 x g por 1 min) com tampão M9 (21 mM Na2HPO4·7H2O (hidrogenofosfato dissódico heptahidratado), 22 mM (dihidrogenofosfato de potássio) KH2PO4, 86 mM cloreto de sódio (NaCl), 1 mM MgSO4·7H2O (sulfato de magnésio heptahidratado), adicione dH2O até 1 L).
- Deixe-os eclodir no tampão M9 com agitação suave durante a noite (O/N) a 20 °C. O desenvolvimento do verme será interrompido no estágio L1 na ausência de uma fonte de alimento, deixando uma população sincronizada. Transfira L1s para placas frescas de Meios de Crescimento de Nematóides (NGM) semeadas com bactérias OP50 E. coli e deixe a progênie se desenvolver até a idade desejada.
- Prepare almofadas de agarose a 2% (em H2O) em uma lâmina de microscópio conforme descrito.
- Prepare duas lâminas de microscópio com fita adesiva colocadas em todo o seu comprimento para serem usadas como espaçadores. Coloque uma terceira lâmina de microscópio entre eles.
- Dissolva a agarose a 2% em H2O e pipete uma gota na lâmina limpa.
- Coloque uma quarta lâmina perpendicular às outras três lâminas no topo da gota de ágar. Pressione-o suavemente para achatar a almofada com a mesma espessura da fita adesiva.
- Deixe secar por 1 minuto antes de remover os espaçadores e separar suavemente as lâminas. A almofada de ágar grudará em um deles.
- Pipete ~ 10 μl de anestésico (2 mM de levamisol em tampão M9) para a almofada e transfira ~ 10 animais usando um palito de fio de platina. Cubra com uma lamínula (~22 x 22 mm) e tire fotos em 1 hora.
- Alternativamente, para adquirir filmes por um longo período de tempo ou para reduzir ainda mais a possibilidade de qualquer movimento dos animais, use uma combinação de anestésico e imobilização de contas.
- Prepare almofadas de agarose a 10% (em tampão M9) conforme descrito e adicione vermes a uma solução padrão de tamanho de nanoesfera de 3 μl (grânulos de poliestireno, 100 nm) mais 3 μl de anestésico (4 mM de levamisol em tampão M9). Cubra suavemente com uma lamínula. Para evitar a dessecação, sele a lamínula com VALAP (uma mistura de quantidades iguais de vaselina, lanolina e cera de parafina).
- Imagem de vermes imobilizados usando um microscópio confocal.
NOTA: Os resultados são obtidos usando um microscópio confocal AF de disco giratório equipado com uma câmera EM-CCD e software de automação de microscopia e análise de imagem, como o MetaMorph, descrevem os detalhes abaixo, mas outros sistemas de imagem confocal comparáveis também podem ser usados.
- Use a objetiva de óleo 63X ou 100X/1.4NA e coloque a lâmina do microscópio contendo vermes no suporte da lâmina do microscópio.
- Abra o software. Ajuste a potência do laser e os filtros para imagens mRFP. Use o laser de 561 nm a 10% de potência e filtro de emissão >600 nm.
- Abra "Aquisição multidimensional". Na guia "Principal", marque as caixas "Timelapse" e "Executar diários" (Foco automático de hardware: desativado).
- Na guia "Salvar", selecione ou crie a pasta do diretório onde os arquivos devem ser salvos. Atribua um nome ao arquivo.
- Na guia "Comprimento de onda", selecione a iluminação apropriada e ajuste a exposição e o ganho. Use "YokoQuad Red" (ou uma configuração de iluminação equivalente para imagens mRFP) com uma exposição entre 100 e 300 ms e um ganho de câmera entre 100 e 300, dependendo da amostra individual (avaliada usando a imagem ao vivo).
- Na guia "Timelapse", selecione "Número de pontos de tempo" = 301, "Duração" = 5 min e "Tempo/Intervalo" = 1 seg.
- Na guia "Diários", selecione Diário: "AFC SET Z HOLD" e "AFC Return to Z HOLD", Digite: "Especial" (duas vezes), Ponto inicial: "Início do ponto de tempo" e "Fim do ponto de tempo". Essa opção de foco automático é importante para criar imagens da mesma seção por um longo período de tempo.
- Quando a configuração estiver concluída, pressione "Adquirir". O vídeo em timelapse é salvo como arquivos TIFF separados.
