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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Produção e purificação de vírus adeno-associados recombinantes (rAAV)
Nota: a produção e purificação do vetor rAAV foram realizadas pelo Núcleo de Vetor Viral de Leuven (LVVC).
- Resumidamente, transfecte células HEK 293T subconfluentes subconfluentes de baixa passagem (<50) usando uma solução de transfecção de NaCl de polietilenimina linear 25kD 150 nM e três plasmídeos diferentes em uma proporção de 1:1:1 em meio DMEM 2% de soro fetal bovino. Após 24 horas de incubação a 37 °C em CO2 a 5%, substituir o meio por meio DMEM fresco a 2% de soro fetal bovino.
nota: Os plasmídeos incluem as construções para o sorotipo AAV7, o plasmídeo de transferência AAV que codifica a alfa-sinucleína mutante A53T humana (α-SYN) sob o controle do promotor da sinapsina1 aprimorada por CMVie e o plasmídeo auxiliar adenoviral pAdvDeltaF6.
- Colha o meio 5 dias após a transfecção transitória e concentre usando filtração de fluxo tangencial.
- Purificar as partículas vectoriais rAAV do meio concentrado utilizando um gradiente de iodixanol.
- Use técnicas padrão de PCR em tempo real para determinação de cópia genômica (GC). Neste protocolo, um título vetorial de 3,0 E11 GC/ml foi usado para desenvolver um modelo de rato baseado em α-SYN para a doença de Parkinson (DP).
2. Injeção estereotáxica do vetor rAAV α-SYN na substância negra (SN) do rato (Figura 1)
- Ratos Wistar fêmeas de oito semanas de idade, pesando cerca de 200-250 g em um ciclo normal de 12 horas de luz / escuridão com livre acesso a alimentos peletizados e água da torneira.
- Submeta o rato a anestesia intraperitoneal (i.p.) contendo uma mistura de cetamina (60 mg/kg) e medetomidina (0,4 mg/kg). Uma vez que o rato esteja anestesiado e não reaja ao apertar as diferentes patas, administre um microtransponder por via subcutânea nas costas do rato para reconhecimento adicional usando um implantador de microtransponder. Verifique se o microtransponder está posicionado corretamente e pode ser lido pelo dispositivo de leitura.
- Corte o cabelo em cima do couro cabeludo. Aplique um anestésico local no couro cabeludo e nas orelhas. Realize o restante do procedimento cirúrgico sob fluxo laminar usando técnicas assépticas.
- Coloque os ratos em uma estrutura de cabeça estereotáxica usando duas barras de ouvido, uma boca e uma barra de nariz. Cubra o corpo do rato com um cobertor de papel para evitar uma queda na temperatura corporal. Aplique um lubrificante ocular para evitar que os olhos sequem.
- Desinfete o couro cabeludo com jodium 1% em isopropanol 70% e faça uma pequena incisão na linha média do couro cabeludo. Raspe suavemente as membranas do crânio e enxágue com solução salina. Deixe o crânio secar por alguns minutos. Observe as suturas cranianas e os dois pontos de referência: Bregma e Lambda.
- Para injetar o vetor rAAV no SN, defina as coordenadas em direção ao Bregma (ântero-posterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm; e dorsoventral: 7,2 mm calculado a partir da dura-máter).
nota: As coordenadas tridimensionais para cada região de interesse podem ser calculadas usando um atlas estereotáxico do cérebro de ratos, aplicando Bregma como ponto de referência anatômico.
- Encher uma seringa de microinjecção de 10 μl (calibre 30 20 mm) com o vector rAAV e colocá-la no instrumento estereotáxico ligado a uma bomba de microinjecção motorizada. Controle o volume liberando uma gota de vetor e elimine em um detergente de limpeza polivalente pH 9 (por exemplo, RBS).
- Verifique visualmente se a cabeça está fixada em linha reta na estrutura da cabeça e avalie o eixo esquerda-direita. Defina visualmente cuidadosamente as coordenadas ântero-posterior e mediolateral para Bregma e Lambda e meça sua altura usando uma agulha de calibre 30 de 20 mm no braço dorsoventral do quadro estereotáxico.
- Deixe uma diferença máxima de 0,3 mm de altura entre Bregma e Lambda. Coloque a agulha de volta no Bregma e aplique as coordenadas ântero-posterior e médio-lateral movendo o braço ântero-posterior e médio-lateral do quadro estereotáxico.
- No local da injeção, meça a altura do crânio e certifique-se de que não difere mais de 0,3 mm da altura do Bregma. Faça um furo no crânio com um diâmetro de aproximadamente 2 mm. Meça a altura da dura-máter, que servirá de referência para a aplicação da coordenada dorsoventral. Alternativamente, subtraia uma espessura fixa para o crânio (0,9 mm).
- Penetre na dura-máter usando uma agulha de calibre 26 e absorva o sangue com tecido estéril. Aguarde até que todo o sangramento tenha parado antes de prosseguir.
- Insira lentamente a seringa de microinjeção de 10 μl pré-carregada com solução vetorial no cérebro até a profundidade pré-determinada (coordenada dorsoventral). Aguarde 1 min com a agulha no lugar. Injete 3 μl de solução vetorial (3,0 cópias do genoma E11 / ml (dose vetorial média) ou 1,0 E12 GC / ml (alta dose vetorial) de rAAV2 / 7 α-SYN ou vetor de controle eGFP) usando a bomba de microinjeção motorizada com um rendimento de 0,25 μl / min.
- Após a injeção, mantenha a agulha no lugar por mais 5 minutos antes de removê-la lentamente. Costure o couro cabeludo com poliéster trançado revestido 3.0, desinfete com jodium a 1% em isopropanol a 70% e remova suavemente o animal do instrumento estereotáxico. Primeiro afrouxe a barra do nariz e da boca, depois as duas barras auriculares.
- Para reverter a anestesia, injete no rato por via intraperitoneal 0,5 mg / kg de atipamezol e coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento a 38 ° C até que ele acorde. Cubra o rato com um cobertor de papel para evitar uma queda na temperatura corporal.
- Forneça fácil acesso a comida e água nas primeiras horas. Monitore o rato nos primeiros dias. Se necessário, aplique analgesia.
nota: Não há necessidade de remover os pontos do crânio. Após 1-2 semanas, o crânio está completamente reparado e os pontos se soltam.
