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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Homogeneização e Fracionamento
- Seleção de tecidos
NOTA: Tecido do córtex frontal post-mortem congelado de controle saudável (Ctl) e casos de DA confirmados patologicamente foram selecionados (n = 2). A avaliação neuropatológica post-mortem da distribuição da placa amilóide foi realizada de acordo com os critérios de pontuação semiquantitativos do Consórcio para Estabelecer um Registro para a Doença de Alzheimer, embora a patologia do emaranhado neurofibrilar tenha sido avaliada de acordo com o sistema de estadiamento de Braak.
- Obtenha tecido cerebral post-mortem congelado de casos de controle saudável (Ctl) e confirmados patologicamente pela DA. Utilizando recipientes de gelo seco, fórceps e uma lâmina de barbear, extirpe porções de ~ 250 mg de substância cinzenta de cada amostra de tecido em barcos de pesagem descartáveis, tomando cuidado para evitar que o tecido descongele. Registre o peso de cada peça a ser homogeneizada.
- Extirpar ~ 250 mg de substância cinzenta usando fórceps e navalha, inspecionando visualmente para localizar a interface entre a substância cinzenta externa e a substância branca interna. Evite a substância branca e, mais importante, quaisquer grandes vasos sanguíneos ou regiões sangrentas, meninges ou aracnóides. Mantenha o tecido congelado durante o processo de corte, trabalhando rapidamente e com frequência, colocando o barco de pesagem com tecido cerebral em recipientes de poliestireno com gelo seco.
- Registar o peso exacto da substância cinzenta excisada de cada peça congelada utilizando uma balança analítica. Calcule o volume de tampão com baixo teor de sal (LS) (ver Tabela 1) necessário para a homogeneização por pressão (5 mL / g ou 20% p / v).
- Prepare 10 mL de tampão LS com 1x coquetel de inibidores de protease e fosfatase e leve à geladeira.
- Remova o lenço pesado e o barco de pesagem do gelo seco e corte em pedaços de aproximadamente 2 x 2 mm à medida que descongela. Transfira para um tubo homogeneizador pré-resfriado de 2 mL com gelo.
- Adicione 5 mL / g (20% p / v) de tampão com baixo teor de sal (LS) gelado com 1X protease e coquetel inibidor de fosfatase.
- Homogeneizar o tecido cerebral no gelo usando aproximadamente 10 golpes de pilão de alta folga A e 15 golpes de pilão de baixa folga B.
- Transfira todo o homogeneizado para um tubo de polipropileno de 2 mL usando uma pipeta de vidro Pasteur. Rotule o tubo com "TH" (Homogenato Total), o número da caixa do tecido e o volume do homogeneizado. Alíquota 0,8 mL em um tubo de 1,5 mL rotulado. Qualquer homogenato em excesso pode ser aliquotado de forma semelhante e armazenado a -80 °C.
- Para cada alíquota de 0,8 mL, adicione 100 μL de NaCl 5 M e sarkosil 10% (p / v) nas concentrações de 0,5 M e 1% p / v, respectivamente. Misture bem os tubos por inversão e incube no gelo por 15 min. Rotular os tubos com "TH-S" (Homogeneizado Total-Sarkosyl) para indicar que os homogeneizados estão em tampão sarkosil (Tabela 1).
- Sonicar cada tubo por três pulsos de 5 s a 30% de amplitude no gelo (intensidade máxima = 40%) usando uma sonda de microponta.
- Determinar as concentrações proteicas dos homogeneizados usando o método de ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
nota: A concentração média de proteína dos homogeneizados TH-S preparados a 5 mL de LS por grama de tecido é de 15-20 mg/mL. Os homogeneizados podem ser fracionados imediatamente ou armazenados a -80 °C até o uso.
- Diluir homogeneizados de TH-S a 10 mg / mL usando tampão sark gelado (Tabela 1) com 1x inibidores de protease e fosfatase.
- Transfira 5 mg de proteína (0,5 mL) de cada homogeneizado TH-S para tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 μL e balanceie em pares com tampão sark. Carregue os tubos em um rotor pré-resfriado e ultracentrífuga a 180.000 x g por 30 min a 4 °C. Transfira os sobrenadantes solúveis em sarkosil (S1) para tubos de 1,5 mL e armazene a -80 °C.
NOTA: (Lavagem opcional) Adicione 200 μL de tampão sark aos tubos da ultracentrífuga contendo as frações insolúveis em detergente (P1) e desaloje os pellets (P1) do fundo dos tubos da ultracentrífuga usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
- Gire brevemente os tubos invertidos por 2-3 s (≤2.500 x g) em uma microcentrífuga para transferir os pellets (P1) e tampão para os tubos de 1,5 mL abaixo. Ressuspenda os pellets insolúveis (P1) no tampão sark pipetando para cima e para baixo para garantir que o pellet seja interrompido.
- Balanceie em pares e centrifugue a 180.000 x g por mais 30 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante de lavagem opcional (S2) e incube os pellets insolúveis em sarkosil (P2) em 50-75 μL de tampão ureia (Tabela 1) com 1x PIC (coquetel de inibidores de protease e fosfatase) por 30 min em temperatura ambiente para solubilizar o pellet.
nota: Aqueça o tampão de ureia à temperatura ambiente antes de usar para evitar a precipitação de SDS. Para aplicações sensíveis a detergentes, omita o SDS do tampão de ureia e considere lavar o pellet insolúvel (P2) em tampão com baixo teor de sal antes de ressuspender em tampão de ureia.
- Transfira os pellets ressuspensos (P2) para tubos de 0,5 mL e use sonicação breve (1 s) de microtip a 20% de amplitude (intensidade máxima = 40%) para solubilizar totalmente os pellets.
- Determinar as concentrações proteicas das fracções sarkosil-solúvel (S1) e -insolúvel (P2) utilizando o método do ensaio BCA. Utilizar imediatamente estas fracções ou conservar a -80 °C até à utilização.
Tabela 1: Lista de buffers
| Solução de sarkosil a 10% p/v: 10 g de sal de N-lauril-sarcosina sódica por 100 ml de ddH2O (agitar em RT durante a noite) |
| Tampão com baixo teor de sal (LS): 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA |
| Tampão Sarkosyl (sark): Tampão LS + 1% (p/v) sarkosyl + NaCl 0,5 M |
| Tampão ureia (armazenar a -20 °C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M ureia, 2% SDS |