Avaliação da função motora em um modelo experimental de neurite autoimune em camundongo

Abstract

Fonte: Gonsalvez, D. G., et al., Uma abordagem simples para induzir neurite autoimune experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o processo de avaliação da disfunção motora em um modelo de camundongo por meio da administração de toxina coqueluche e um inóculo contendo peptídeos e adjuvantes que imitam a mielina, seguidos de testes em esteira para avaliar a função motora e avaliar o dano nervoso resultante devido à ativação imunológica e desmielinização.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Indução de EAN (Neurite Autoimune Experimental)

NOTA: O EAN pode ser induzido com sucesso em camundongos C57BL/6 machos com idade entre 6 e 8 semanas. O protocolo de indução leva 9 dias no total. O dia 0 refere-se ao dia da primeira imunização. Para este protocolo, as injeções foram realizadas sob anestesia (ver passo 1.1.2 abaixo).

1. No Dia -1:
   1. Prepare a solução de toxina da coqueluche (ver Tabela de Materiais) de 1,6 μg / mL usando solução salina estéril 0,1 M tamponada com fosfato isotônico de camundongo (MT-PBS).
   2. Anestesia com isoflurano:
      1. Coloque o camundongo (C57BL/6, macho, 6-8 semanas) na câmara de anestesia e ajuste o fluxo de oxigênio para 1 L/min.
      2. Ligue o vaporizador de isoflurano, ajuste-o para 2,5% para anestesia, monitore a respiração e aguarde 2 minutos ou até que os reflexos primários (córnea e membros posteriores) não respondam mais.
   3. Remova o camundongo da câmara de anestesia e administre 250 μL da solução de toxina da coqueluche acima por meio de uma injeção intraperitoneal (i.p.) usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 30_1/2 G.
   4. Prepare o inóculo injetável para imunização:
      1. Prepare a Solução A usando solução de 2 mg / mL de peptídeo P0180-199 (com > 98% de pureza, sequência S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) em solução salina a 0,9%.
      2. Prepare a Solução B usando uma solução de 20 mg / mL de Mycobacterium tuberculosis (ver Tabela de Materiais) no adjuvante completo de Freund (FCA, compreendendo 15% de monoolato de mannida + 85% de óleo de parafina e 0,5 mg / mL de Mycobacterium butyricum morto e seco desidratado).
      3. Para fazer o inóculo final para injeção, combine partes de volume igual das Soluções A e B em um batedor de esferas e misture-as na velocidade máxima por 1 min em temperatura ambiente.
         nota: As soluções A e B podem ser conservadas em stock e armazenadas a 4 °C durante um período máximo de um mês, mas o inóculo final combinado deve ser preparado de novo no dia da injecção no ratinho.
2. No dia 0, administre 50 μL do inóculo (preparação descrita na etapa 1.1.4) em um camundongo por meio de uma injeção subcutânea usando uma agulha 23 G.
   nota: A injeção pode ser colocada entre as omoplatas ou entre o membro posterior e a cauda sobre o dorso caudal.
3. No dia 1, faça a solução de toxina coqueluche de 1,2 μg/mL (em MT-PBS) e administre 250 μL em um camundongo por injeção intravenosa usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 301/2 G.
4. No dia 3, repita a etapa 1.3 acima.
   nota: As soluções-mãe A e B podem ser preparadas e armazenadas a 4 °C durante um período máximo de um mês. No entanto, o inóculo injetável final, produzido pela combinação das soluções de reserva A e B, deve ser feito no dia da injeção.
5. No dia 8, administrar 50 μL do inóculo (preparação descrita na etapa 1.1.4) em um camundongo por injeção subcutânea (ver etapa 1.2 acima) no mesmo local de injeção da etapa 1.2 (para cada animal)

2. Avaliação da função motora

NOTA: O desempenho motor é avaliado em paralelo com a pontuação clínica para a mesma coorte de animais. O aparelho de avaliação da função motora deve ser conectado a um computador que tenha um sistema de imagem da função da marcha (consulte a Tabela de Materiais) instalado. Recomenda-se também que todos os ratinhos a avaliar estejam habituados à tarefa de corrida antes da indução do EAN. Para fazer isso, a prática (2 testes por camundongo) é realizada três dias antes da indução da doença (Dia -3).

1. Ligue o aparelho de avaliação da função motora e ligue o botão de luz.
2. Aperte o mouse com firmeza e pinte seus pés, abaixando-o em um recipiente cheio de tinta vermelha enquanto segura sua cauda.
   nota: Esta etapa é necessária para a cepa C57BL/6, mas pode ser ignorada se uma cepa de camundongo com uma cor de pelagem branca estiver sendo usada.
3. Coloque o mouse no compartimento de caminhada e defina a velocidade da esteira em 15 cm/s.
4. Ligue a esteira e clique no botão "gravar" para capturar o movimento de corrida do mouse usando o sistema de imagem da função de marcha (consulte a Tabela de Materiais).
5. Use um cronômetro e meça cada corrida por 36 s. Após 36 s, pare a gravação e pare a esteira.
   nota: Os mouses que não conseguem concluir com êxito a tarefa em execução para este intervalo de 36 s são considerados como tendo falhado.
6. Salve o arquivo de vídeo na pasta designada.
7. Repita as etapas acima para cada mouse a ser avaliado. Teste os mouses com a mesma tarefa de execução a cada 3 dias.
8. Analise os arquivos de vídeo editados usando software para parâmetros de função de marcha (ver Tabela de Materiais).
   nota: Os detalhes de como analisar diferentes parâmetros do motor variam entre os softwares, portanto, consulte as instruções do fabricante antes da análise. Dependendo dos objetivos específicos da pesquisa, os tecidos animais podem ser coletados em qualquer estágio da avaliação da função pós-motora para obter evidências histológicas de danos axonais e mielinos por meio de imuno-histoquímica ou microscopia eletrônica.

Results

Tabela 1: paradigma do escore clínico EAN.

pontuação	Critérios	Notas e comentários sobre os critérios de avaliação
0	Mouse normal
1	Menos animado OU espumado	Isso é avaliado em re...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, macho, 6-8 semanas de idade	Centro Australiano de Recursos Biológicos, WA, Austrália
Toxina da coqueluche	Lista Biological Laboratories, Inc., CA, EUA	#181
0,1 M de solução salina tamponada fosfatada isotônica de camundongo (MT-PBS)			Os laboratórios terão seu próprio protocolo.
Isoflurano	Pharmachem, QLD, Austrália		Os laboratórios terão seu próprio protocolo de administração.
Peptídeo P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Tenente SHG, CHN		P0180–199, sequência S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
O calor matou Mycobacterium tuberculosis (cepa H37RA)	Difco, MI, EUA	#231141
Adjuvante completo de Freund (FCA)	Difco, MI, EUA	#263910
16% de paraformaldeído (PFA)	Serviços de Microscopia Eletrônica	#15710	Diluir para 4% de PFA no dia da coleta de tecido.
25% de glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Austrália	#11-30-8	Diluir para 2,5% de glutaraldeído no dia da fixação.
Azida de sódio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Austrália	SL189	Crie 10% (p/v) de estoque em 0,1 milhão de toneladas de pbs. Use a 0,03% (v/v).
sacarose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Austrália	SA030	Utilizar a 30% (p/v).
Temperatura de corte ideal (OCT) média	Sakura Finetek, Califórnia, EUA	#4583
Soro de burro normal	Merck Millipore, MA, EUA	#S30-100	Use como diluente de anticorpos a 10% (v / v) ou outra concentração determinada pelo próprio laboratório.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, EUA	#90o2-31-1	Utilização em diluente de anticorpos a 0,3% (v/v) ou outra concentração determinada pelo próprio laboratório.
Proteína precursora anti-amilóide de coelho (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, EUA	S12700	Usado a 1:400 ou titulado em laboratório próprio.
Proteína 1 associada à anti-contactina de coelho (Caspr)	Presente do Prof. Elior Peles, Instituto Wiezmann de Ciência, Israel		Usado a 1:500 ou titulado em laboratório próprio.
Anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor apropriados	Sondas Moleculares (Life Technologies), OR, EUA	vário	Use a 1:200 ou titule em laboratório próprio. A escolha da espécie em que o anticorpo foi criado e a Alexa Fluor escolhida fica a critério de cada laboratório.
Solução de montagem aquosa	Dako (Agilent), Califórnia, EUA	#S3023	Cada laboratório terá sua preferência.
equipamento
Seringa de 0,5 ml com agulhas de 301/2 g	Bd	#326105
Agulhas de 23 g	Bd	#305143
Almofada de tinta vermelha			Qualquer almofada de tinta vermelha ou corante alimentar vermelho pode ser usado para marcar os pés dos animais.
Aparelho DigiGate (inclui esteira)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Sistema de imagem DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
cronômetro			Qualquer cronômetro pode ser usado.
Software DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscópio de dissecação	Zeiss		Pode ser utilizado qualquer microscópio de dissecação adequado.
Slides carregados	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cirostato	Leica		Pode ser utilizado qualquer cirostato adequado.
Equipamento de perfusão e instrumentos de dissecação			Os laboratórios terão seus próprios protoctols de perfusão.
Câmara humificada opaca			Os laboratórios podem produzir seus próprios usando um recipiente de plástico opaco.
Pap pene	GeneTex (EUA)		Lápis de cera ou tensão superficial também podem ser usados para criar um poço ao redor da seção de tecido.
Microscópio confocal	Zeis LSM780		Qualquer microscópio confocal com linhas de laser apropriadas pode ser usado.
FIJI/Imagem J	Institutos Nacionais de Saúde		Disponível a partir de www.fiji.sc