Imagem e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de drosófilas geneticamente modificadas

Resumo

Fonte: Donnelly, K. M., et al. Monitorando a transmissão célula a célula de agregados de proteínas semelhantes a príons em Drosophila Melanogaster. J. Vis. (2018)

Este vídeo demonstra imagens e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de Drosophila geneticamente modificados. Os cérebros são fixados, lavados e tratados com um agente antidesbotamento antes da montagem. As imagens são capturadas usando um microscópio confocal e quantificadas para observar a transmissão de agregados de proteínas mutantes.

Protocolo

1. Expressão do transgene Htt mediado por Gal4 e QF em Drosophila

1. Coletar e/ou gerar linhagens transgênicas de Drosophila melanogaster contendo "drivers" Gal4 ou QF específicos do tecido, bem como linhagens contendo transgenes Htt de tipo selvagem ou mutantes a jusante do Gal4-UAS ou QF-QUAS. Certifique-se de que as proteínas expressas a partir desses transgenes sejam fundidas a proteínas fluorescentes ou marcadas com epítopos para permitir a diferenciação de produtos transgênicos Htt mutantes e selvagens na mesma mosca. Veja a Figura 1.
   NOTA: Normalmente usamos fragmentos do exon 1 do gene Htt humano. No entanto, a....

Resultados

Figura 1. Uma abordagem genética para expressão acoplada de transgenes Htt mutantes e selvagens usando os sistemas de expressão binária QF-QUAS e Gal4-UAS. Na "célula A", a proteína Htt mutante marcada com mCherry contendo um trecho poliQ de comprimento patogênico (Q91) é expressa usando um driver QF localizado a jusante de um promotor específico de tecido A ("PA"). Na "célula B", um Htt de tipo selv.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10X, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Diluir para 1X
Tritão X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Científico	2904F24
20% de paraformaldeído (PFA)	Ciências da Microscopia Eletrônica	15713-S
Soro de cabra normal (NGS), filtrado	Laboratórios Biológicos Lampire	Rolamento 7332500	Alíquota e congelamento após o recebimento
Frango anti-GFP	Laboratórios Aves	GFP-1020	Use na diluição de 1:500
Coelho anti-DsRed	Clontech	632496	Use na diluição de 1:2000; pode reconhecer proteínas fluorescentes à base de DsRed (por exemplo, mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot	Banco de Hibridoma de Estudos do Desenvolvimento	Próximo a 82	Use na diluição de 1:100; rotulará estruturas pré-sinápticas ativas em todo o cérebro da mosca
FITC anti-frango	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Utilizar a uma diluição de 1:250
Alexa Fluor 568 anti-coelho	Tecnologias da Vida	Rolamento A11011	Utilizar a uma diluição de 1:250
Anticorpo anti-camundongo Alexa Fluor 647	Tecnologias da Vida	A21235	Utilizar a uma diluição de 1:250
Reagente Antidesvanecimento Dourado Slowfade	Tecnologias da Vida	S36936
Lâminas de microscópio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Científico	12-550-143
Vidro de cobertura (22 x 22 mm)	Globo Científico	1404-15
Fórceps Dumont Biology Grade, Estilo 3	Ted Pella	503	Uso na mão não dominante
Fórceps Dumont Biology Grade, Estilo 5	Ted Pella	505	uso na mão dominante
Software de análise de imagem LAS X	Leica
Software de análise de imagens Imaris	Plano de bits