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1. Expressão do transgene Htt mediado por Gal4 e QF em Drosophila
- Coletar e/ou gerar linhagens transgênicas de Drosophila melanogaster contendo "drivers" Gal4 ou QF específicos do tecido, bem como linhagens contendo transgenes Htt de tipo selvagem ou mutantes a jusante do Gal4-UAS ou QF-QUAS. Certifique-se de que as proteínas expressas a partir desses transgenes sejam fundidas a proteínas fluorescentes ou marcadas com epítopos para permitir a diferenciação de produtos transgênicos Htt mutantes e selvagens na mesma mosca. Veja a Figura 1.
NOTA: Normalmente usamos fragmentos do exon 1 do gene Htt humano. No entanto, as moscas transgênicas podem ser geradas para expressar fragmentos de Htt mais longos ou outros genes, se desejado.
- Planeje a estratégia genética de modo que os transgenes Htt mutantes e selvagens sejam expressos em populações de células distintas e não sobrepostas.
- Se ocorrer alguma sobreposição de expressão, as proteínas Htt mutantes e selvagens sintetizadas nas mesmas células se agregarão e impedirão a detecção de eventos semelhantes a príons. Para evitar isso, use os repressores específicos Gal4 e QF, Gal80 e QS40, respectivamente (Figura 1). A seleção de drivers de Gal4 e/ou QF controlados pelo desenvolvimento pode ajudar a restringir a expressão de Htt mutante a células pós-mitóticas, eliminando a possibilidade de que a divisão celular possa contribuir para a disseminação agregada célula a célula.
- Usando condições de cultura padrão, acasale as moscas para gerar progênie que expresse Htt mutante via QF (ou Gal4) em uma população de células "doadoras" e Htt do tipo selvagem via Gal4 (ou QF) em uma população de células "receptoras". Veja a Figura 1 para um esquema mostrando uma possível combinação genética.
nota: Os drivers QF e Gal4 que foram usados para gerar os dados mostrados nas Figuras 1-4 e em nossa publicação anterior incluem o driver do neurônio receptor olfativo DA1 (ORN), Or67d-QF, e o driver pan-glial, repo-Gal4.
- Gerar moscas de controle em paralelo que expressam Htt de tipo selvagem em populações de células marcadas com QF e Gal4.
- Coletar progênie do genótipo desejado e envelhecer os animais conforme apropriado.
2. Microdissecção e fixação de cérebros adultos de Drosophila
NOTA: Este procedimento de dissecção foi modificado de uma publicação anterior e pode ser usado para preparar cérebros para imagens de sinais de fluorescência direta de fusões de proteínas fluorescentes Htt.
- Colete os seguintes materiais e coloque no gelo: solução salina tamponada com fosfato contendo 0,03% de Triton X-100 (PBS/T); tubos de microcentrífuga contendo 970 μL de solução fixadora de paraformaldeído (PFA) a 4% preparada pela adição de 200 μL de PFA a 20% de 770 μL PBS/T; um prato de vidro transparente contendo poço; uma pipeta de transferência descartável; duas pinças de dissecação (uma nº 3 e outra nº 5).
- Anestesie as moscas adultas usando CO2 e transfira-as para um poço do prato de vidro no gelo.
- Usando uma pipeta de transferência, adicione uma pequena quantidade (~ 500 μL) de PBS/T frio ao poço que contém as moscas e a um poço vazio. Evite introduzir muitas bolhas, pois elas podem interferir na dissecção.
- Coloque o prato de vidro em uma superfície plana abaixo de um microscópio de dissecação e ajuste a ampliação até que o corpo da mosca preencha o campo de visão e esteja em foco.
- Posicione um par de fontes de luz pescoço de ganso de forma que a luz ilumine os dois lados do prato de vidro. Ancore um tecido de laboratório dobrado sob o prato de vidro para descartar partes do corpo/cutículas durante a dissecção.
- Usando a pinça nº 3 na mão não dominante, transfira uma única mosca para o poço contendo PBS / T. Imobilize a mosca agarrando seu abdômen com o lado ventral voltado para cima.
- Mantendo a braguilha totalmente submersa em PBS/T, remova a cabeça da braguilha com a pinça nº 5 na mão dominante. Insira uma ponta dessas pinças sob a cutícula no pequeno espaço adjacente à tromba em um lado da cabeça da mosca. Prenda o aperto na cabeça apertando a pinça para segurar o olho de ambos os lados.
- Remova a cabeça da mosca de seu corpo separando as duas pinças. Descarte o corpo da mosca em um tecido de laboratório posicionado nas proximidades. Mantenha a pressão na pinça da mão dominante para que a cabeça da mosca não seja perdida.
- Posicione uma ponta da pinça nº 3 na mão não dominante no mesmo pequeno espaço sob a cutícula do outro lado da tromba. Uma vez posicionado, aperte a pinça para segurar os olhos no mesmo local em ambos os lados da cabeça.
- Assim que o aperto na cutícula estiver seguro, separe suavemente a pinça a 180°. Esta ação quebrará a cutícula da cabeça sem danificar o cérebro. Descarte os resíduos da cutícula em um tecido de laboratório.
- Embora ideal, a cutícula da cabeça pode não ser totalmente removida em uma única etapa. Nesse caso, remova a cutícula peça por peça até que o cérebro esteja totalmente exposto. Tome cuidado para não danificar o cérebro, evitando o contato direto com o fórceps.
- Remova o cérebro dissecado do PBS/T agarrando uma traqueia anexada ou aspirando o cérebro para o espaço entre as pontas da pinça por ação capilar.
nota: A remoção da traqueia é opcional, pois tende a não obscurecer os lobos antenais na superfície anterior do cérebro, onde normalmente visualizamos. No entanto, se a traqueia interferir na imagem, remova-a com cuidado para que o cérebro não seja danificado por essa manipulação.
- Transfira o cérebro da mosca para um dos tubos de microcentrífuga contendo uma solução fixadora no gelo. Certifique-se de que o cérebro se desprenda da pinça e fique submerso na solução fixadora.
- Uma vez que todos os cérebros tenham sido dissecados, submeta-os a uma "correção curta", colocando os tubos fechados em um nutador por ~ 5 min em temperatura ambiente no escuro.
NOTA: Esta curta etapa de fixação garante que os cérebros sejam mais fáceis de manusear nas etapas subsequentes e não adiram às laterais do tubo da microcentrífuga.
- Remova a maior parte da solução fixadora com uma pipeta P1000 e descarte-a.
- Evite aspirar cérebros do tubo durante esta e qualquer etapa de lavagem subsequente. Defina o P1000 para um volume menor (por exemplo, 650 μL) e remova o sobrenadante em duas etapas. Além disso, mantenha os tubos da microcentrífuga alinhados com uma fonte de luz (por exemplo, luzes suspensas) enquanto aspira para visualizar melhor os cérebros.
- Adicione 1 mL de PBS / T fresco ao cérebro. Lave rapidamente (< 1 min) no escuro, aspire o sobrenadante do cérebro e descarte.
- Repita a lavagem com PBS/T no escuro à temperatura ambiente de acordo com o seguinte horário: 2 lavagens rápidas (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min e 1 X 1 h de lavagem. Prenda as tampas dos tubos de microcentrífuga e coloque os tubos em um nutador entre as lavagens.
- Se a coloração DAPI for desejada, substitua a lavagem final de 1 h por 1 X 30 min de incubação com 250 ng/mL de DAPI diluído em PBS/T, seguido por 2 X lavagens rápidas e 1 X 20 min.
- Após a última lavagem, remova a maior parte do sobrenadante do tampão de lavagem, tomando cuidado para não perturbar o cérebro, e adicione 30 μL de reagente antidesbotamento à base de glicerol ao cérebro. Incubar a 4 °C no escuro, sem movimentos, durante pelo menos 1 h e até 24 h.
3. Montagem de todo o cérebro
- Coloque uma lâmina de microscópio de vidro sob um microscópio de dissecação e etiquete-a com informações de identificação.
NOTA: Alternativamente, os cérebros podem ser montados diretamente em uma lamínula para acessar ambos os lados do cérebro durante a imagem. Um protocolo descrevendo esse procedimento de montagem foi publicado anteriormente45.
- Remova os cérebros de cada tubo de microcentrífuga usando uma ponta de pipeta embotada (preparada com uma lâmina de barbear para remover o fundo ~ 1 cm de uma ponta de 1-200 μL) e transfira-os para o meio da lâmina. Transfira o mínimo possível de reagente antidesbotamento com o cérebro.
- Use uma pinça para posicionar os cérebros na orientação desejada (por exemplo, dorsal apontando para o topo da lâmina e superfície anterior voltada para cima para obter imagens do lobo antenal). Ao orientar os cérebros, considere o caminho da luz do microscópio a ser usado para obter imagens.
- Remova o excesso de reagente antidesbotamento da lâmina usando o canto pontiagudo de um tecido de laboratório dobrado sem perturbar o cérebro. Deixe o slide descansar por ~ 5-10 min no escuro para permitir que os cérebros adiram ao slide.
- Cerque os cérebros das moscas com quatro pequenos pedaços de vidro quebrado colocados em cada lado dos cérebros para formar um quadrado de ~ 19 mm x 19 mm. Coloque uma borda de um vidro de cobertura nº 1,5 de 22 mm x 22 mm do lado de fora de um desses pequenos pedaços de vidro e abaixe suavemente a lamínula sobre os cérebros para completar a montagem da ponte.
- Dispense lentamente um novo reagente antidesbotamento para preencher a superfície abaixo da lamínula, tomando cuidado para não perturbar a lamínula ou o cérebro. Limpe qualquer excesso de antidesbotamento usando o canto pontiagudo de um tecido de laboratório dobrado sem entrar em contato direto com a lamínula.
- Adicione uma gota de esmalte transparente e de secagem rápida em cada um dos quatro cantos da lamínula. Deixe secar por ~ 10 min. Em seguida, sele as quatro bordas da lamínula com esmalte para envolver completamente os miolos.
- Faça a imagem imediatamente do cérebro ou armazene a 4 °C até que esteja pronto.
- Se a imagem da fluorescência intrínseca de fusões de proteínas fluorescentes Htt, faça imagens dos cérebros dentro de 24 horas para obter o melhor sinal.
4. Imagem e Quantificação da Transmissão de Agregados Semelhantes a Príons
- Visualize os cérebros montados usando um microscópio confocal equipado com uma objetiva de óleo 40X ou 60 / 63X para coletar imagens de fatia z através da região do cérebro onde os drivers Gal4 e QF selecionados são expressos (Figura 2A, B).
- Excite as fusões de proteínas fluorescentes ou proteínas imunomarcadas usando os lasers apropriados (por exemplo, 488 nm para GFP/YFP/FITC ou 552 nm para mCherry/Cy3). Defina janelas de detecção que capturem um sinal fluorescente máximo enquanto eliminam a diafonia de canal usando um sistema de detecção espectral ou filtros de emissão passa-banda/passa-longa específicos para cada fluoróforo.
NOTA: Esteja atento ao obter imagens de agregados de proteínas. É fácil para os pixels no centro de cada agregado ficarem saturados, especialmente em agregados maiores. Tente minimizar a saturação na imagem, mas esteja ciente do risco de perder o sinal de espécies agregadas menores (Figura 2B, C, D). Muita saturação aumentará o fundo da imagem, dificultando a identificação de pontos isolados. Teste diferentes configurações de imagem para otimizar antes de tirar as imagens finais em cada conjunto de dados.
- Analise os dados quantificando os pontos individuais manualmente, movendo-se através de fatias z individuais (por exemplo, Figura 2C e Figura 4A) ou depois de renderizar as fatias confocais em 3 dimensões (Figura 3A, B).
nota: Isso pode ser feito no Image J ou em outro software de processamento de imagem.
- Se os agregados estiverem bem separados e houver fluorescência de fundo mínima, use um software de análise de imagem para identificar, quantificar e analisar sistematicamente os agregados como "objetos" ou "superfícies" distintos em uma reconstrução 3D da pilha confocal (Figura 3B).
nota: As ações de software descritas são específicas para o instrumento e software usados aqui (consulte a Tabela de Materiais).
- Visualize uma série z confocal no modo de visualização 3D. Use o assistente "Análise" para identificar pontos individuais em um canal selecionado (por exemplo, o canal vermelho para agregados HttQ91-mCherry na Figura 3). Ajuste o limite e os filtros para representar com precisão todos os agregados de tamanho heterogêneo como objetos individuais na imagem.
- Ative "Dividir objetos" em "Pré-filtro de processamento binário" para separar agregados intimamente associados que são mesclados de forma aberrante pelo algoritmo de software. Observe que o número total de objetos e suas medidas associadas é relatado em "Medidas"
nota: Este método para quantificar agregados de Htt mutantes não é passível de protocolo de imunocoloração porque o centro dos agregados amilóides é impenetrável aos anticorpos. Como resultado, os agregados aparecem no microscópio como estruturas semelhantes a anéis e o software de análise de imagem é incapaz de identificar e distinguir esses "pontos individuais" com precisão.
- Quantifique os agregados Htt do tipo selvagem movendo-se manualmente pela pilha z e pontuando os agregados Htt do tipo selvagem, garantindo que nenhum agregado seja pontuado duas vezes se aparecer em mais de uma fatia (Figura 4A).
nota: Essa abordagem de quantificação manual pode ser usada quando o número de agregados em cada pilha confocal é razoável (por exemplo, 20-50). Também é útil quando o software de análise de imagem não consegue distinguir pontos individuais do sinal circundante no mesmo canal (por exemplo, o sinal de Htt difuso do tipo selvagem em células próximas) (Figura 2B, C e Figura 4A). Quantificar agregados de Htt do tipo selvagem também pode ser um desafio porque muitas estruturas normais no cérebro parecem pontilhadas (por exemplo, processos celulares e sinapses). A co-localização de sinais Htt de tipo selvagem e mutante pode ser usada como critério de seleção; no entanto, é possível que algumas "sementes" mutantes de Htt caiam abaixo do limite de detecção do confocal. Uma proteína diferente de Htt que não se agrega nas células receptoras (por exemplo, GFP) pode ser usada para rotular estruturas pontilhadas não relacionadas no cérebro.
- Use o software de análise de imagem para realizar uma caracterização adicional de agregados individuais. Por exemplo, determine a distribuição de tamanho dos agregados (Figura 3C), a co-localização percentual entre as proteínas Htt mutantes e selvagens (Figura 4A) ou meça diretamente as interações proteína-proteína usando FRET (Figura 4B).
- Determine a distribuição de tamanho de pontos individuais usando um algoritmo de detecção de ponto ou superfície que identifica com precisão todos os agregados visíveis em um canal específico. Use o software de análise de imagem para fazer medições relevantes dos pontos ou superfícies, por exemplo, obtenha informações de 'diâmetro agregado' (Fig. 3C), 'volume' ou 'intensidade' de 'Medições' no assistente de software "Análise" descrito na etapa 4.2.1.
nota: Na Figura 3C, relatamos a distribuição de diâmetros para todos os puncta HttQ91-mCherry identificados em um único glomérulo DA1.
- Determine a colocalização percentual entre os agregados HttQ25-YFP e HttQ91-mCherry movendo manualmente fatia por fatia por meio de uma pilha z confocal (o método mais preciso). No entanto, tome cuidado para não contar nenhum agregado duas vezes. Para evitar isso, conte apenas os agregados em uma fatia z específica se o plano de foco estiver no centro do agregado (Figura 4A).
- Calcule a eficiência do FRET para agregados HttQ25-YFP induzidos com sinal HttQ91-mCherry colocalizado usando o método de fotobranqueamento aceitador.
- Primeiro, elimine a possível diafonia entre os canais YFP e mCherry, estabelecendo janelas de detecção para sinais somente mCherry e somente YFP que não produzem sinal no outro canal. Usando essas configurações, tire uma 'imagem anterior' de pontos HttQ25-YFP individuais e seu sinal HttQ91-mCherry associado (Figura 4B).
- Em seguida, fotobranqueie o sinal mCherry ajustando o laser vermelho (por exemplo, 552 nm) para 100% de intensidade e faça a varredura até que o sinal desapareça. Reverta para as configurações usadas para a 'imagem anterior' e tire uma 'imagem posterior' do mesmo ponto (Figura 4B).
- Calcule as medições de intensidade de fluorescência para cada ponto antes e depois do fotobranqueamento usando um software de análise de imagem.
- Calcular a eficiência do FRET subtraindo a fluorescência do dador YFP medida na «imagem anterior» (YFPinicial) da fluorescência do dador YFP na «imagem posterior» (YFPfinal). Divida esse valor por YFPfinal e multiplique por 100,
nota: A eficiência do FRET pode ser calculada pixel a pixel ou geral para cada agregado HttQ25-YFP (Figura 4B). O fotobranqueamento aceitador é uma técnica particularmente útil para calcular a eficiência do FRET quando o sinal mCherry associado a cada ponto HttQ25-YFP é suficientemente alto para produzir extinção detectável de YFP após fotobranqueamento mCherry.
