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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparando o mouse para a cirurgia
- Remova o mouse da gaiola inicial e pese (g).
- Coloque o mouse em uma câmara de indução de isoflurano e defina o oxigênio para 2 L / min e o vaporizador de isoflurano para 5 para induzir um plano cirúrgico de anestesia, cerca de 3-5 min. Monitore a respiração lenta e a imobilização. Verifique se o mouse está totalmente sedado usando o reflexo de pinça do dedo do pé.
- Quando o mouse estiver totalmente sedado, coloque-o em uma estrutura estereotáxica e prenda o nariz no cone do nariz, que é preso com um tubo ao isoflurano. Insira as barras auriculares no canal auditivo e aperte, garantindo que a cabeça esteja estável.
- Raspe a cabeça de orelha a orelha e de entre os olhos até atrás das orelhas.
- Esterilize a pele com toalhetes alternados de álcool isopropílico e solução de iodo betadina, 3 vezes cada.
- Aplique lágrimas artificiais em ambos os olhos para evitar que sequem durante o procedimento cirúrgico.
2. Procedimento Cirúrgico
- Monitore a profundidade da anestesia beliscando o dedo do pé ou a cauda. O camundongo está no plano cirúrgico apropriado quando não há resposta e a respiração é lenta e uniforme.
- Faça uma incisão na pele parassagital logo atrás dos olhos até quase entre as orelhas em um único movimento firme usando uma lâmina de bisturi nº 11. Mova a pele para o lado e prenda o lado direito com o hemostático.
- Limpe o crânio da membrana sobrejacente usando o lado opaco do bisturi nº 11 e aplicadores com ponta de algodão. Opcionalmente, limpe o crânio com um aplicador com ponta de algodão embebido em solução salina a 0,9%. Deixe secar completamente.
- Com uma régua pequena, marcar a borda anterior da craniotomia a 1 mm caudal à sutura coronal e a borda esquerda da craniotomia a 1 mm lateral à sutura sagital (Figura 1) com um marcador permanente. Em seguida, marque as bordas direita e caudal da craniotomia a 4 mm das suturas sagital e coronal, respectivamente (Figura 1).
- Usando uma broca de 0,5 mm, comece a fazer uma craniotomia perfurando lentamente seguindo o contorno do marcador permanente. Certifique-se de não romper o crânio completamente. Pressione suavemente o pedaço isolado de osso parietal com uma pinça nº 5, as áreas de fraqueza cederão à pressão. Quando o osso afinado estiver suficientemente fraco em todo o perímetro, a peça óssea estará pronta para remoção.
nota: Se o investigador tiver dificuldade em remover o osso inteiro, isso sugere que o osso não foi suficientemente diluído durante a perfuração. Considere perfurar ainda mais o crânio em animais subsequentes para facilitar a remoção fácil da peça óssea.
- Usando uma seringa de 10 ml equipada com uma agulha de 23 G, aplique uma pequena quantidade de solução salina a 0,9% para embeber o osso isolado e a área perfurada.
- Fixe o braço manipulador ao equipamento estereotáxico. Conecte uma nova lâmina de bisturi nº 11 ao suporte da sonda com o lado afiado da lâmina voltado para o rostral.
nota: Embora os tecidos rostral e caudal experimentem as bordas afiadas e rombas da lâmina, respectivamente, o dano mecânico induzido pela lesão penetrante é comparável em toda a extensão da lesão. Não observamos diferenças apreciáveis nas principais características da gliose reativa, incluindo regulação positiva da expressão ou proliferação de GFAP, entre as seções rostral e caudal.
- Mantendo o braço manipulador fora do caminho, levante cuidadosamente o osso isolado usando uma pinça angular 5/45. Insira a ponta da pinça na lateral do osso isolado e levante, usando uma alavanca para puxar o pedaço de osso deixado para trás em um movimento completo.
nota: Tenha cuidado para não esfaquear o cérebro ou perturbar a dura-máter embaixo do crânio.
- Pegue um pequeno pedaço da espuma de gel absorvível embebida e coloque-a no cérebro descoberto para evitar que seque e absorva qualquer sangue que possa estar presente.
- Assim que a espuma de gel estiver no lugar, gire o braço do manipulador no lugar e ajuste a lâmina no centro da craniotomia sobre a espuma de gel. Remova a espuma de gel e abaixe a lâmina até que a ponta toque na dura-máter sem perfurá-la. Marque as coordenadas dorsais / ventrais usando a escala vernier no braço vertical do estereotáxico.
- Usando o braço do manipulador, abaixe lentamente a lâmina precisamente 3 mm no cérebro. Isso é conseguido usando as marcações de escala vernier no braço do manipulador. Deixe a lâmina permanecer no lugar por 5 a 10 segundos. Mova o braço estereotáxico com a fixação da lâmina rostral para caudal três vezes, permitindo que a lâmina alcance os limites rostral e caudal da craniotomia antes de se mover para a extremidade oposta.
nota: A dura-máter não é removida antes de inserir a lâmina. Em contraste com a dura-máter de rato, que tem ~ 80 μm de espessura7, a dura-máter de camundongo é consideravelmente mais fina (apenas algumas camadas de células de espessura) e não produz uma resistência apreciável à lâmina do bisturi durante a inserção. Use uma nova lâmina de bisturi para cada camundongo para garantir que cada animal receba uma lesão consistente.
- Levante lentamente o braço estereotáxico, removendo a lâmina do cérebro. Após a remoção da lâmina, coloque imediatamente outro pedaço de espuma de gel na superfície do cérebro para absorver qualquer excesso de sangue ou fluido.
- Enquanto isso, remova o braço estereotáxico e descarte a lâmina do bisturi nº 11. Assim que o sangramento parar, remova a espuma de gel.
- Feche a ferida suturando a pele com suturas não absorvíveis, como ethilon ou prolene. As suturas devem ser removidas 9 a 10 dias após a cirurgia.
- Retorne o mouse para sua gaiola inicial e permita que o mouse se recupere lentamente em uma almofada de aquecimento e monitore quaisquer sinais de angústia. A recuperação da anestesia induzida por isofluorano geralmente ocorre dentro de 2-5 minutos após a remoção do isofluorano. Não deixe o animal sem vigilância até que ele tenha recuperado a decúbito esternal.
- Administre 0,5-1 ml de solução de Ringer com lactato por via subcutânea para garantir a hidratação.
