Avaliação da colonização bacteriana em um cérebro de camundongo após infecção por Listeria monocytogenes

Resumo

Fonte: Ghosh, P., et al., Infecção cerebral por Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a quantificação da carga bacteriana infecciosa do cérebro de camundongo perfundido infectado com Listeria monocytogenes.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Extração de órgãos e determinação de cargas bacterianas

1. Após a perfusão, colha os órgãos (por exemplo, fígado, baço) removendo cuidadosamente qualquer vasculatura e ligamentos ligados e colocando os órgãos separadamente em um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril frio (4 ° C). Armazene as amostras no gelo até que ocorra um processamento adicional.
2. Para colher o cérebro, decapite a cabeça atrás das orelhas usando uma tesoura e corte a pele do couro cabeludo entre os olhos do animal na linha média. Se necessário, apare o excesso de tecido, mantendo a tesoura pressionada contra o crânio.
   1. Insira suavemente uma ponta da tesoura no forame magno (o orifício na base do crânio através do qual a medula espinhal passa) e corte lateralmente no crânio em ambos os lados.
   2. Corte suavemente o crânio entre os olhos do roedor na linha média, aplicando pressão lateral. Evite perturbar o cérebro e mantenha o mínimo de contato entre o tecido cerebral e a tesoura.
   3. Usando uma pinça de ponta fina, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e a base do crânio para remover o cérebro.
      nota: Isso resulta no rompimento das fibras nervosas cerebrais.
   4. Transfira cuidadosamente o cérebro para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de PBS frio estéril.
   5. Descarte a carcaça do rato e repita essas etapas para os animais restantes.
      nota: Depois que todos os órgãos forem colhidos, limpe a área do procedimento e prepare-se para a homogeneização dos órgãos para determinar as cargas bacterianas.
3. Limpe e esterilize a ponta de um homogeneizador de tecidos colocado em um gabinete de biossegurança, inserindo a ponta e executando o homogeneizador por 10 s sequencialmente em alvejante a 5%, água estéril, etanol a 75% e água estéril, cada um contido em um tubo cônico separado de 15 mL.
4. Homogeneizar o cérebro infectado (~ 20 s na configuração 6, rpm máxima) no tubo cônico de 15 mL até que não restem fragmentos de tecido visíveis.
   1. Limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 1.3 para evitar a contaminação bacteriana para o próximo órgão sample.
   2. Realize o processo de homogeneização para todos os outros órgãos (por exemplo, fígado, baço).
   3. Quando o processo de homogeneização estiver concluído, limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 1.3 e guarde-o até o uso posterior.
5. Preparar diluições seriadas de 10 vezes dos homogeneizados de órgãos em PBS estéril e plaquear as diluições em placas de ágar BHI / estreptomicina para determinar a UFC por órgão.
   NOTA: Um método semelhante é realizado para determinar a UFC por mL de sangue.
   1. Depois de todas as diluições estarem plaqueadas, transferir as placas para uma incubadora a 37 °C durante a noite.
   2. No dia seguinte, conte o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mL de sangue da seguinte forma:
      UFC/órgão = (número de colônias x fator de diluição) / mL de homogeneizado plaqueado x 5
      UFC/mL de sangue = (número de colônias x fator de diluição) / mL de sangue plaqueado

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de infusão de cérebro e coração	Becton Dickinson	Rolamento 237200
Sulfato de estreptomicina	Amresco	0382-50G
Placas de Petri	VWR	Rolamento 25384-342
Glicerol	VWR	Rolamento 97062-832
Homogeneizador Básico IKA T18 ULTRA-TURRAX	IKA	3352109	Modelo: T18BS1
espectrofotômetro	Beckman Coulter	Série DU 800
Ratos BALB/c	Laboratório Jackson	Modelo #000651
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	Nº 60004
Tubos cônicos de 15 ml	VWR	21008-918
Solução salina tamponada com fosfato	Corning	46-013-CM
Espátula de aço inoxidável	VWR	82027-520
Tesoura de aço inoxidável (4,5 pol.)	VWR	82027-578
Pinça de ponta fina de aço inoxidável (6 pol.)	VWR	82027-406