Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Extração de órgãos e determinação de cargas bacterianas
- Após a perfusão, colha os órgãos (por exemplo, fígado, baço) removendo cuidadosamente qualquer vasculatura e ligamentos ligados e colocando os órgãos separadamente em um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril frio (4 ° C). Armazene as amostras no gelo até que ocorra um processamento adicional.
- Para colher o cérebro, decapite a cabeça atrás das orelhas usando uma tesoura e corte a pele do couro cabeludo entre os olhos do animal na linha média. Se necessário, apare o excesso de tecido, mantendo a tesoura pressionada contra o crânio.
- Insira suavemente uma ponta da tesoura no forame magno (o orifício na base do crânio através do qual a medula espinhal passa) e corte lateralmente no crânio em ambos os lados.
- Corte suavemente o crânio entre os olhos do roedor na linha média, aplicando pressão lateral. Evite perturbar o cérebro e mantenha o mínimo de contato entre o tecido cerebral e a tesoura.
- Usando uma pinça de ponta fina, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e a base do crânio para remover o cérebro.
nota: Isso resulta no rompimento das fibras nervosas cerebrais.
- Transfira cuidadosamente o cérebro para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de PBS frio estéril.
- Descarte a carcaça do rato e repita essas etapas para os animais restantes.
nota: Depois que todos os órgãos forem colhidos, limpe a área do procedimento e prepare-se para a homogeneização dos órgãos para determinar as cargas bacterianas.
- Limpe e esterilize a ponta de um homogeneizador de tecidos colocado em um gabinete de biossegurança, inserindo a ponta e executando o homogeneizador por 10 s sequencialmente em alvejante a 5%, água estéril, etanol a 75% e água estéril, cada um contido em um tubo cônico separado de 15 mL.
- Homogeneizar o cérebro infectado (~ 20 s na configuração 6, rpm máxima) no tubo cônico de 15 mL até que não restem fragmentos de tecido visíveis.
- Limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 1.3 para evitar a contaminação bacteriana para o próximo órgão sample.
- Realize o processo de homogeneização para todos os outros órgãos (por exemplo, fígado, baço).
- Quando o processo de homogeneização estiver concluído, limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 1.3 e guarde-o até o uso posterior.
- Preparar diluições seriadas de 10 vezes dos homogeneizados de órgãos em PBS estéril e plaquear as diluições em placas de ágar BHI / estreptomicina para determinar a UFC por órgão.
NOTA: Um método semelhante é realizado para determinar a UFC por mL de sangue.
- Depois de todas as diluições estarem plaqueadas, transferir as placas para uma incubadora a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte, conte o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mL de sangue da seguinte forma:
UFC/órgão = (número de colônias x fator de diluição) / mL de homogeneizado plaqueado x 5
UFC/mL de sangue = (número de colônias x fator de diluição) / mL de sangue plaqueado