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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Protocolo de imunofluorescência
- Dissecção tecidual
- Sacrifique o peixe-zebra por submersão em água gelada (5 partes de gelo/1 parte de água, 4 °C); deixe-os até a cessação de todos os movimentos para garantir a morte por hipóxia.
- Remova a cabeça com uma lâmina de barbear. Remova o tecido mole do lado ventral do crânio com uma pinça. Abra o crânio e remova o osso do lado ventral do cérebro. Remova a pele e os ossos do crânio do lado dorsal do cérebro. Remova o cérebro.
- Fixação tecidual
- Fixe o cérebro por imersão por 3 h em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 ° C.
- Prepare o tampão fosfato 0,1 M (PB) dissolvendo 1,755 g de NaH2PO4H2O e 4,575 g de Na2HPO4 em 450 mL de água destilada (dH2O) e ajuste para um pH de 7,4 com a quantidade necessária de NaOH 1N.
- Prepare 4% de PFA dissolvendo 4 g de PFA em 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4) por agitação em uma placa de aquecimento. Quando uma temperatura de 60 °C for atingida, adicione 2-4 gotas de NaOH 1N para obter uma solução límpida. Deixou PFA 4% à temperatura ambiente (RT) e controlou o pH . Ajuste o pH para 7,4.
nota: O tempo de fixação depende do tamanho do tecido. A fixação do tecido por mais de 4 a 6 h pode levar à superfixação, que mascara os antígenos e limita a ligação anticorpo-epítopo.
- Incorporação de tecidos
- Enxágue os lenços 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
- Para a crioproteção, transferir os tecidos para sacarose a 20% em PB (0,1 M, pH 7,4) e manter durante a noite a 4 °C. Em seguida, transfira os tecidos para sacarose a 30% em 0,1 M PB (pH 7,4) e mantenha por mais uma noite a 4 °C.
- Incorpore os tecidos em um bloco de composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para fazer isso, prepare um pequeno dewar de nitrogênio líquido, pegue papel alumínio e corte-o ao meio para criar uma panela. A panela que contém os tecidos preenchidos com o composto OCT deve ser mergulhada no azoto líquido até ao arrefecimento do composto OCT. Os tecidos congelados podem ser armazenados a -80 °C até à secção.
- Corte de tecidos
- Transferir os blocos de tecido congelado para um criostato a -20 °C e cortar em cortes coronais ou sagitais de 10 μm.
- Coletar os tecidos em cortes seriados alternados em lâminas de vidro adesivas adequadas para imuno-histoquímica e armazená-los a -20 °C até o uso.
nota: Armazene as lâminas entre -20 °C e 4 °C em uma caixa de slides escura ou livro de slides.
- Bloqueio de locais de ligação inespecíficos e permeabilização tecidual
- Demarcar a área do tecido na lâmina com uma caneta resistente a solventes.
- Enxágue as seções 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar as seções com soro de burro normal a 1% dissolvido no tampão de permeabilização PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) por 30 min em RT para permeabilizar a membrana celular e bloquear os locais de ligação inespecíficos.
- Prepare Triton X-100 0,3% dissolvendo 0,3 mL de Triton X-100 em 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4).
- Prepare a solução de bloqueio dissolvendo o soro normal de burro a 1% em PB contendo 0,3% de TritonX-100.
nota: As espécies animais do soro usado nos tampões de permeabilização e bloqueio são dependentes do hospedeiro do anticorpo secundário.
- Incubação com mistura de anticorpos primários
- Enxágue as seções 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar as seções durante a noite em uma caixa úmida em RT com uma mistura de anticorpos primários diluídos em PB-T. As seguintes misturas de anticorpos primários podem ser usadas: anticorpo de cabra contra o receptor de orexina (OX-2R) diluído 1:100/anticorpo de coelho contra receptor canabinóide (CB1R) diluído 1:100, ou anticorpo de cabra contra peptídeo de orexina (OX-A) diluído 1:100/anticorpo de coelho contra CB1R diluído 1:100.
- Incubação com mistura de anticorpos secundários
- Enxágue as seções 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubar as seções por 2 h em RT com 1) uma mistura de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 anti-coelho de burro e anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 de burro diluído 1:100 em PB-T; ou 2) uma mistura de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 488 anti-cabra de burro e anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 594 de burro diluído 1:100 em PB-T.
nota: Use anticorpos secundários desenvolvidos no mesmo hospedeiro animal. O soro normal deve pertencer à mesma espécie de anticorpo secundário (por exemplo, usar anticorpos secundários desenvolvidos em burro e um soro normal de burro). Dilua os anticorpos primários e secundários com tampão de bloqueio contendo o detergente para aumentar a permeabilização celular e reduzir o fundo.
- Montagem de tecido
- Enxágue as seções 3x por 5 min cada, com 0,1 M PB (pH 7,4).
- Contra-corar as seções com corante nuclear DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) preparado dissolvendo 1,5 μL de DAPI (1 mg/mL) em 3 mL de PB.
- Lâminas de lamínula com suporte de montagem (ver Tabela de Materiais). Este meio de montagem aquoso estabiliza a amostra de tecido e as manchas para uso a longo prazo. As amostras fluorescentes podem ser armazenadas no escuro a 4 °C. Para prolongar a vida útil dos fluoróforos, use um meio de montagem antidesbotamento.
nota: Escolha um bom meio de montagem. Um dos parâmetros mais importantes dos agentes de montagem é o índice de refração (nD), que deve estar em torno de 1,5, o índice de refração do vidro. O meio de montagem usado aqui pode ser usado especialmente com amostras preparadas para determinações de enzimas e lipídios (ou seja, amostras que não devem ser desidratadas com uma série ascendente de álcool).
- Controles
- Repita as seções 1.1–1.8, omitindo o anticorpo primário ou secundário, ou substituindo na etapa específica os anti-soros primários ou secundários por PB (controle negativo).
- Repita as seções 1,1–1,8, pré-absorvendo cada anticorpo primário com um excesso do peptídeo relativo (100 mg de peptídeo / 1 mL de anti-soro diluído).
- Repita as seções 1.1–1.8 em fatias de cérebro de camundongo (controle positivo).
nota: Prepare todos os tampões frescos, pouco antes de começar. Remova o excesso de fluido cuidadosamente em cada etapa com uma pipeta ou papel de filtro ao redor das seções, mantendo sempre a seção úmida.